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标题:[分享帖]美国的流式水平面临严峻考验

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发表于 2012-3-6 13:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[分享帖]美国的流式水平面临严峻考验



Microtubule Disruption and Tumor Suppression by Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase 4，是2007年11月15号发表在Cancer Research上的一篇研究论文。
我们的研究生在阅读过程中看到了其中的疑问，过来求证。经过讨论，我们认为这篇文章包含了严重的实验失误，于是先和文章的通讯作者联系，给他发去一封信，大意是：
你们研究小组依据做出结论的流式分析部分的资料有严重可疑之处。
首先，我们根据自己的流式经验判断这四张直方图里的DNA含量分布的CV值明显超过3，不能使用固定门分析，而应该使用Modfit拟合。
其次也是最严重的问题，我们认为4张直方图里的首峰的移动不是细胞由control组的G1向最大处理（第6天）组的G2/M移动，而是不同程度地加大了处理组的PMT电压，将G1峰推到G2/M的荧光强度的位置而造成的假象。为了证明你们实验的真实性，我建议你们将原始的流式数据文件发给我们，我们在这边的BD机器上用Modfit重新进行分析。在不gate FS-SS初始门的情况下，碎片和死亡细胞的低染峰应该位于首峰前的相对固定位置，不会随着首峰移动，这样就可以确认PMT电压没有被人为移动过；如果随着首峰移动，我们认为你们的流式数据造假！
第三，在方法学和研究内容里你们都没有说明直方图有没有gate FS-SS初始门，当然，我们判断应该是gate了，因为不gate的话那么多的碎片和死亡细胞肯定会反映在直方图的浅染区，但是我们在那里看不到有分布。既然是gate了，那么G2/M堆积和死亡就没有直接关系，因为gate的只能是大圈，而你们认为只有小红圈gate的才是死细胞。你们的论证因此很不充分，结论不合理。
最后附上我们在流式工作方面的介绍，以免他们认为我们没有资格评论他们。

我将不停地向大家汇报事情的进展。
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发表于 2012-3-6 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PDF文件压缩了都放不上来，就把相关的图截下来。
这是很有教育意义的一个例子，建议论坛上做流式的和准备做流式的同学都要好好分析一下。


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发表于 2012-3-6 13:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Microtubule Disruption and Tumor Suppression by Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase 4，是2007年11月15号发表在Cancer Research上的一篇研究论文。
我们的研究生在阅读过程中看到了其中的疑问，过来求证。经过讨论，我们认为这篇文章包含了严重的实验失误，于是先和文章的通讯作者联系，给他发去一封信，大意是：
你们研究小组依据做出结论的流式分析部分的资料有严重可疑之处。
首先，我们根据自己的流式经验判断这四张直方图里的DNA含量分布的CV值明显超过3，不能使用固定门分析，而应该使用Modfit拟合。
其次也是最严重的问题，我们认为4张直方图里的首峰的移动不是细胞由control组的G1向最大处理（第6天）组的G2/M移动，而是不同程度地加大了处理组的PMT电压，将G1峰推到G2/M的荧光强度的位置而造成的假象。为了证明你们实验的真实性，我建议你们将原始的流式数据文件发给我们，我们在这边的BD机器上用Modfit重新进行分析。在不gate FS-SS初始门的情况下，碎片和死亡细胞的低染峰应该位于首峰前的相对固定位置，不会随着首峰移动，这样就可以确认PMT电压没有被人为移动过；如果随着首峰移动，我们认为你们的流式数据造假！
第三，在方法学和研究内容里你们都没有说明直方图有没有gate FS-SS初始门，当然，我们判断应该是gate了，因为不gate的话那么多的碎片和死亡细胞肯定会反映在直方图的浅染区，但是我们在那里看不到有分布。既然是gate了，那么G2/M堆积和死亡就没有直接关系，因为gate的只能是大圈，而你们认为只有小红圈gate的才是死细胞。你们的论证因此很不充分，结论不合理。
最后附上我们在流式工作方面的介绍，以免他们认为我们没有资格评论他们。

我将不停地向大家汇报事情的进展。

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

首先申明，不是故意抬杠
1）不知道LZ说的"CV值明显超过3，不能使用固定门分析"典出何方，我们这边用的是8，汗一个，望指教，也好及时纠正错误。

2）你有什么理由他通过调动PTM来造假呢？从图上是如何看出来的，能解释一下么？我个人的感受是，LZ用了一句“我们认为”就盖帽子了，似乎草率了吧，如果要在cancer research上造这种假，与其在流式技术上造假，不如直接在标本上造假，用点G2/M阻滞的细胞应该不难吧，为什么要通过调动流式细胞仪这种容易出问题的手段呢。

3）从图上看，我认为直方图的数据来源于大GATE，而死亡细胞定义为小GATE，确实是不能直接而绝对的说明死亡是由于G2/M阻滞造成的，但是考虑到两者的同步增加的吻合性，作者认为药物处理诱导了G2/M阻滞，进而死亡，G2/M "associated death"也不是不可以把。说实话，作者在这里的分析是有难度的，因为这起“死亡”细胞看起来细胞形态等等都发生了剧烈变化，估计要结合细胞面积等等来分析DNA含量也是相当麻烦吧，LZ好像太苛求了一点，呵呵

总之，我们拭目以待，看是LZ“火眼金睛”还是“操之过急”。

此外提个意见，LZ的流失水准甚高，但是帖子总是语焉不详，让人云山雾罩，无助于其帮助大家提高流式分析水平的本意
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 小中大
在Howard M. Shapiro第四版的Practical Flow Cytometry（2003年）里面，第448页开始详细讲述了DNA含量分析的原理、方法和应用。其中在第449页Shapiro写到他的一位朋友Jerry Fried，世界上首先建立DNA直方图数学模型的其中一位专家，认为如果样本DNA有CV小于3%的干净（很少碎片和二聚体）分布，那么用肉眼（人为确定水平门）都可以较准确地估算周期比例。但是CV再大意味着各期互侵变得明显，水平门已经不可能准确分析各期数据，所以才有使用数学模型对直方图进行去堆叠（deconvolution）处理从而获得相对准确的周期数据的必要性。
我们实验室做周期分析先把610光路校正至CV小于等于1%，即使这样，细胞DNA含量的异质性仍然很难使实测样本的CV缩减到3%以内，所以我们从来都不用水平门获得周期比例，一定用流式附带的MultiCycle做周期分析。
在Shapiro书中第450页有一段专门提到BD的ModFit和BC的MultiCycle的重要性。
尽管IF只有7点几分，Cancer Research也算是肿瘤学基础研究的国际顶级杂志之一，我认为对研究方法和研究过程的严格要求肯定也必须是这类杂志的办刊宗旨。从这个角度出发，第一点的失误已经需要对数据进行重新计算，对文章进行重新修改了，尽管我认为这点还不足以构成致命伤。
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 小中大
受教了，我们甚少对周期进行分析，呵呵，要好好的和BD的技术支持理论一番了。

你怀疑他作假是这么看出来的呢？
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发表于 2012-3-6 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我可以用下面的图来说明他为什么错。
下面的图红色代表G0/G1,紫色是S期，蓝色代表G2/M。首先如果要得出这篇文章作者所预期的结果，图应该是这样一个趋势。
为什么他错：
1.未经过特殊处理，细胞不可能的在他所画的S期门内出现惊人的同步分裂。在2天的相隔时间内，处于G0/G1细胞同时以十分缓慢的速度进行DNA的合成，以致在S其出现这么一个巨大的峰型移动。

2.大家可以从周期图看出，他的G2/M期第二幅图向右偏移，第三幅图开始没有明显的G2/M期，为什么？按照他的理论，不是会被抑制在G2/M期吗？为什么会突然消失，然后在第4副图全部出现？难道从观察开始，他们为了和其他细胞同步化分裂成G0/G1，然后以上面一条的方式一起峰移？
不是！大家可以在那个最大的峰横坐标两倍的地方看到一个峰，这个就是G2/M！这个就是他推电压的痕迹！应为电压推大，CV值变大，在峰面积不变的情况下，峰就会变得越矮越胖，而且他的位置永远是G0/G1期横坐标的两倍，所以细心点观察可以看到，第二幅图的峰和第三幅图的峰渐渐向右，并且变矮变胖。最后第四幅的时候应为被挤出了图（作者还是很狡猾的），所以我们看不见了。而且S期变得越来越低。

3.其实正如我的示意图所示，只要细胞分裂的速度不变，S期的比例是基本不变的，也不会形成峰型，S期的比例可以作为细胞生长状态的指标。或许是我读的文献还不够，不过希望有高手指正我这个说法。


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发表于 2012-3-6 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面红色标明G2/M峰的移动，紫红色是标明峰底宽度，可以从另外一个侧面表明其CV值得改变，和他改变电压的效果。


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 小中大
我们认为第二点是最严重的，是因为下述的道理而怀疑，同时我们表达的意思很明确：严重怀疑而非定罪。
我们是这样表述的：
首先，“我们认为4张直方图里的首峰的移动不是细胞由control组的G1向最大处理（第6天）组的G2/M移动，而是不同程度地加大了处理组的PMT电压，将G1峰推到G2/M的荧光强度的位置而造成的假象。”这是表明我们对这部分实验数据的真确性产生了怀疑，我们有自己的看法。为什么呢？第一，周期分析的经验提醒我们无论怎么阻滞都不会出现只剩一个阶段的周期分布，假如第六天的结果是真实的，意味着G0/G1和S期基本消失，只剩G2/M，这在我们的周期分析回顾中从来没有出现过。第二，从control也就是0天到第二、第四天，实际上全周期都存在，G0/G1、S、G2/M没有一个消失，做过周期的人有谁会不认同！这是周期阻滞吗？绝对不是，这是周期移动——全部细胞的DNA荧光信号增强，所以我们可以看到G0/G1和G2/M期变强（右移）、S期延展（向右拉长），阻滞能让所有细胞的DNA含量这样增加吗？逻辑和理论告诉我们这绝不可能。那么是怎么达至这一效果的呢？亲自操作流式测周期的同学就知道，有两种方法可以造成这个后果，一是增加激发光强度，二是加大PMT电压，这两者一前一后，都可以增加同一个细胞被收集到的相关荧光的强度。第三，再来看第四天和第六天，居然第四天已经远强于始发位置的G2/M的荧光强度到第六天回缩到了始发位置（其实仔细观察会发现比始发位置还要更弱一些）！而在前四天越来越多的G0/G1+S（G2/M峰逐渐缩小）居然到第六天突然消失无踪！我分析到这里都禁不住想笑，作者是不是变戏法的呀？！至此我已经有九成的把握这些流式数据是伪造的，根本就是通过增加荧光信号强度的方法向右推整个周期而已，第六天的图其实被作者腰斩了右边的重要部分，猜猜看哪里有什么呢？我打赌那里蹲着一个小小的分布峰——真正的G2/M！其实仔细观察你们就能发现第六天的所谓G2/M峰的右边是有信号的，是一路伸延到右端截边的台地——进一步延展了的可能还没有被完整显示出来的S期！让这种劣行漏了马脚！
既然有读者和同行怀疑了，作者就有必要进行澄清了，怎么澄清呢？“为了证明你们实验的真实性，我建议你们将原始的流式数据文件发给我们，我们在这边的BD机器上用Modfit重新进行分析。”
为什么要这样做呢？为什么这样做有助于澄清事实呢？原理是什么呢？“在不gate FS-SS初始门的情况下，碎片和死亡细胞的低染峰应该位于首峰前的相对固定位置，不会随着首峰移动，这样就可以确认PMT电压没有被人为移动过；如果随着首峰移动，我们认为你们的流式数据造假！”至此，我们说明了我们怀疑的原因，同时也是提供给他们澄清事实真相的方法。
有同学说调流式仪参数容易出问题，我很不以为然。至少Cancer Research的审稿人就看不出来，这说明什么呢？我只能假定绝大部分审稿专家没有亲自接触过流式；我只能假定绝大部分做流式的研究人员没有用心去研究流式，而只是把流式仪看成一台冷冰冰的机器，一部需要就开来测数据的死物。我的想法其实做周期的人一听就明白，是简单的原理，但是兴趣不在其中、都没有习惯去认真全面地观察和思考流式过程的人，就算对着一样的数据又怎么能获得额外的感受呢？
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 小中大
下面红色标明G2/M峰的移动，紫红色是标明峰底宽度，可以从另外一个侧面表明其CV值得改变，和他改变电压的效果。

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调大电压本身会使荧光分布位置右移（荧光强度增大），会使峰型增宽，但是不会明显改变CV值。
在光路一定的情况下（也就是校正好光路后），CV值取决于样本特性而不是检测参数。
所以，你关于峰型位移的说明是正确的，但是关于峰型增宽的说明没有说服力。
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 小中大

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示意图做得很到位！！！
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