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标题:[求助]悬浮细胞转染

guagua[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]悬浮细胞转染




我用K562细胞进行转染，已经转了2次了，但是完全转不进去。第一次是在24孔板上，以每孔1×105细胞接种，质粒是1微克每孔，质粒和脂质体比为1：2；1:2.5和1：3（脂质体为Lipofectamine2000），终体积为600微升，5小时后加入等体积含20%小牛血清的1640培基，36小时后流式下检测发现没有转染率。后来一位师姐告诉我说细胞数太少了，于是第二次我用3×105每孔，还是在24孔板上，以同样的质粒量和质粒与脂质体比，同样的方式转染，还是完全没有转染率。所以来此求助，请求各位高手指点，谢谢咯。
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阿敏[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2000转悬浮细胞的效果不是非常好。
建议用电转或者病毒
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笑弯了腰[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做K562转染啊，不过是稳转，方法和楼主基本相似，5小时候补加培养液，结果48小时后发现细胞都死了，估计是脂质体毒性的问题。
不知道楼主有没有镜检，是否存在这种情况。
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是这样转的，48小时后90%的细胞都死了。。。有同学推荐我使用更好的脂质体，但是我还没有实施。。。
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是稳转哦，但是如果没有转染率的话，直接稳筛，估计效果不好。。。
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你们的悬浮细胞有用摇床吗？
我养的是CHO-DG44,状态一直不好，成团，后来用摇床摇，结果发现很多摇到壁上的就贴在那，死了，用摇床的效果也不好，用LIPO2000转染，也一直转不进去。
有人养DG44？？
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

生物无忧有相关的细胞转染视频，可以对比一下你做的。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议lz把脂质体2000固定3uL，DNA量1，2，3，4做转染 细胞量10^5够了 不要多 其他条件不变试试 我之前用Lip2000做过 相对比较难转染 但是WB还是可以检测到的
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西子[使用道具]
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发表于 2012-3-6 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

悬浮细胞的确很难用lipo2000转染。我曾经用EGFP做过对照，贴壁的一片绿色，悬浮的整个视野只有两三个绿色细胞。
如果一定要用转染的方法，电转效率会稍高一点。
或者用lipoLTX，也是invitrogen的，专门用来转染悬浮细胞和原代细胞等难转的细胞，但价格更贵。
病毒感染的方法效率要高一点点。
不过，我已经做过好几次稳定细胞系的筛选了，最后要么筛不出来，要么筛出来抗药的细胞却根本不表达外源蛋白。很无奈。也许这就是悬浮细胞不好做的地方。
加油吧。文献里悬浮细胞稳定系多的事，人家都能做出来呢，我们也不要轻易放弃。
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qhyu[使用道具]
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 小中大

cd-dg44 是悬浮细胞，当然要用摇床了
lipofectamine2000贴壁转比较的好，悬浮转的话，用pei和freemax 比较的好
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