细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [分享帖]关于乳鼠心肌细胞培养的一点收获

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 13  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[分享帖]关于乳鼠心肌细胞培养的一点收获

daod[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
1

发表于 2012-3-7 08:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[分享帖]关于乳鼠心肌细胞培养的一点收获



在群里浏览了很多次，发现关于乳鼠心肌细胞培养的资料还是几年前的比较多，不知道是不是这几年已经做得很少了。我是今年刚开始做的，发现虽然说方法已经很成熟了，但是做起来还是会有很多的问题的，所以把自己所犯错误总结如下：心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降。
当时我们一开始出现这个问题的时候，首先考虑是不是消化过度的问题，我们用的是0.1％的胰酶消化的，每次的时间都是6分钟左右（消化几次后，组织物少时会缩短时间），以前实验室做的时候也没有问题，后来改用0.08％的胰酶还是不行，又考虑是不是血清，我们用的是Hyclone特级胎牛血清，南美血缘的，考虑是不是不如北美血缘的好，又把实验室各种血清试了一遍，结果还是不好，又检查了CO2温箱的温度和湿度是不是稳定。我们把能换的东西都换了一遍，血清，胰酶浓度，培养板，CO2气，最终我们请教了另外的做心肌细胞培养的人，换用胰酶＋胶原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2.5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
总结来说：
1.0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化
2.消化前后一定要轻柔吹打
3.重悬时要充分吹打，动作轻柔（100次）
4.种板密度要合适
5.当然血清，板都要进口，别图便宜
6.别忘了检查CO2温箱的情况
以上仅供学习参考，希望对大家有用
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
2

发表于 2012-3-7 08:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近养了两次不行.细胞数量,活力差,看不懂动.感觉消化出了问题,怎么消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走.怎么办啊.还有就是怎么把消化后的姨酶尽量吸干啊 ,我总是觉得吸不干净,后来又家姨酶了 ,能不能给我给点好方法啊
顶部
bananapeople[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75315
精华 1
积分 492
帖子 620
信誉分 102
可用分 3964
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-21
状态 离线
3

发表于 2012-3-7 08:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主说的0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化，这个浓度下一般消化多少遍呢？每次消化多长时间？

再请问，接种用的孔板预先铺鼠尾胶原么？具体如果处理的？不知有没有用玻璃瓶的经验？
顶部
daod[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
4

发表于 2012-3-7 08:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
yychen 所说的，出现胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧
顶部
redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
5

发表于 2012-3-7 08:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
yychen所说的，出现胶冻样的东西应该是消化后的碎细胞ＤＮＡ吧．用ＤＮＡ酶消化后就没了．
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
6

发表于 2012-3-7 08:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以后又养了几次,我加大了姨酶的量,冻冻是没了,但搏动还是不行,不知道哪里出了问题.你们有人在养心肌细胞吗?如果有,能否馈赠或者卖0.0307克的Brdu给我 ,量太少,就我一个人用,买一瓶太划不来.先谢谢了.火急!
顶部
kulee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
7

发表于 2012-3-7 08:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼主离心几遍啊？？每离心一遍都要再过滤一次吗？？
顶部
hyuu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79232
精华 1
积分 626
帖子 847
信誉分 102
可用分 5149
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
8

发表于 2012-3-7 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这有BrdU，我想问搂主吹打的程度有多大，会不会把组织打散，我培养的时候静置后组织总是不沉，上清无法洗出是怎么回事啊？
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
9

发表于 2012-3-7 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问 楼主 离心后 还需要 再过滤吗 ？
楼主 是否用差速 贴壁的 方法 ？ 差速多长时间？
我也一直在养心肌，前一段很好，最近不知出了什么问题，要么心肌细胞量很少（成纤维量还行），要么 心肌中混有大量成纤维，干扰试验结果。郁闷中
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
10

发表于 2012-3-7 08:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

0.125%胰酶，37度，消化8分钟，10只鼠大概消化14次，每次胰酶4ml
顶部
 13  1/2 12››