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标题:[求助]原代微血管内皮细胞的培养！

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发表于 2012-3-7 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]原代微血管内皮细胞的培养！



我在作微血管内皮细胞的原代培养，细胞分离后5-7天即出现老化，不知有何方法传代扩增？请教国外，建议采用永生化细胞，可我不想，那位高手有这方面的经验，请不吝赐教！
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发表于 2012-3-7 12:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你是用的什么培养方法？消化？组织块？
老化？是不生长呢？还是死了呢？
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-3-7 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你做的什么动物的微血管？
建议最好用乳鼠或乳兔来做，细胞生长性好些。当然分离的难度也要大些了。
另外，还可以加入内皮细胞生长因子VEGF，血清也最好用进口的胎牛（20%FBS）。

永生化的细胞株目前还有一定的争论，有的杂志不接受这样的稿件。
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发表于 2012-3-7 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上两位的答复,我作肿瘤血管内皮细胞的分离与培养,胶原酶消化,微血管内皮细胞专用培养基培养(含生长因子),细胞生长初期表现尚可,但5-7天后,细胞内出现粗颗粒,细胞老化,停止生长,进而逐渐死亡,虽经换液,大孔传小孔等处理,依然无效;试过多种培养基,结果一样,听实验室老师讲,原代培养细胞就是这种特点,不知二位楼主及其他高手可否赐教一二!万分感谢!
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66小飞侠[使用道具]
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发表于 2012-3-7 12:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

具体原因也不是很清楚，不过一般来说，原代培养的细胞传代能力肯定比不上细胞株，但是传3-5代还是可以的。
看你的培养用品都还不错，而且还是专用培养基，应该是不会有问题的。看看有没有支原体污染？
顺便请教一下，你是怎样分离得到微血管的内皮细胞的？我挺感兴趣的，呵呵
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发表于 2012-3-7 12:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你做的是什么组织的肿瘤微血管内皮细胞，什么肿瘤？
培养液配方？事实上，理论上肿瘤微血管内皮细胞比较幼稚，比正常组织的微血管内皮细胞应该能长得更好一些的。考虑原因可能是你给的生长因子浓度比较低，因为它一惯处于高生长因子浓度的条件下生长，当你在体外给予的生长因子浓度低下的时候，很容易就凋亡了。
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发表于 2012-3-7 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了一点微血管内皮细胞的培养，我想知道你的消化时间和温度不知合不合适，还有培养基里应该加ECGS或ECGF，同时血清最好用进口的胎牛血清，应该传上4-7代没问题。
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49888[使用道具]
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 小中大

我用0.1%IV胶原酶消化，37度，1h，培养基里不仅添加了生长因子，还添加ECGS，血清是进口的胎牛血清，但没用！
我觉得群友的意见值得考虑，增加生长因子的剂量或许有用！
谢谢各位！
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-3-7 12:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做过视网膜内皮细胞的培养，当时没有出现你所说的情况，只是出现了成纤维细胞的大量生长，后来也抑制主了，只要细胞获得生长优势就能演进。这是我的培养基配方，没有细胞生长因子也是可以的，但我们加了视网膜提取物。DMEM（低糖）＋20％FBS完全培养基（DMEM(低糖)、碳酸氢钠3.700g、庆大霉素16万μ、两性霉素3mg、HEPES5.000g、Vitamin C 5mg、肝素钠0.420g、转铁蛋白3mg、胰岛素8μ、L-谷氨酰胺330mg溶于1000ml三蒸水）培养于包被1.5％明胶的培养瓶
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wsll[使用道具]
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发表于 2012-3-7 12:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教：如何以制成纤维细胞生长，具体方法能否告知？为何用低糖型的DMEM？明胶包被正确方法？您的细胞体外能传多少代？最关键的，您采用什么方法鉴定你的内皮细胞纯度？
多谢！
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