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标题:[求助]请教HepG2.2.15和PBMC培养的细节问题？

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发表于 2012-3-7 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请教HepG2.2.15和PBMC培养的细节问题？



实验目的：健脾方刺激后PBMCS对HepG2.2.15细胞病毒的清除作用
实验步骤
1、PBMCS的分离培养；
（1）细胞分离：来源于慢性乙型肝炎病毒复制患者。
肝素抗凝静脉血6ML，用Ficoll—Hypaque密度梯度离心分离，PBS清洗两次后，悬浮于RPMI-1640培养液（含10%人AB型血清、20mmol/L HEPES，2mmol/L谷氨酸、抗生素等），细胞活性用胎盘蓝染色保证在95%以上。
（2）药物血清制备：正常人口服健脾方连续两天，在末次口服后2小时无菌采血，分离血清保存备用。
（3）细胞培养：PBMCS（1x105 cells/100ul）接种于24孔培养板（Costar公司），每样本接种6孔，培养于37度5%CO2培养箱，培养24h，其中3孔换用含药血清，添加浓度为10%，同时设立空白细胞对照3孔，培养3日后，以1×105个/ML HepG2.2.15细胞加入每孔共培养，此后每3日换用同浓度含药血清及空白培养液，并留取培养上清，-20℃保存，9日后收获培养上清后，同时提取细胞内HBV DNA，按基因组DNA抽提试剂盒说明书进行，所有标本于-20℃保存待测。
2、HBsAg、HBeAg和细胞内外HBV DNA、HBV RNA测定
ELISA法测定细胞培养上清HBsAg和HBeAg，方法见说明书，酶标仪450nm处测定每孔4值，3个平行孔取均值后计算抗原抑制率，抗原抑制率＝[(P／N值对照孔-P／N值实验孔)／(P／N值对照孔-2.1)]×100％，50％药物抑制浓度(IC50)＝Anti Log{LogB+[(50-的抑制百分数／(A-的抑制百分数]×C}，A＝＞抑制50％药物浓度，B＝＜抑制50％药物浓度，C＝Log稀释倍数，治疗指数(TI)＝50％中毒剂量(TD50)／IC50。
采用荧光定量PCR法检测总HBV DNA和HBV ccc DNA和整合型HBV DNA以及HBV RNA．按HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作．各反应管放入PE7700自动荧光检测仪，按下列条件扩增：93℃ 2min预变性，然后按93℃ 45s-55℃ 1 min扩增，共10个循环，再按93℃ 30s-55℃ 45s扩增，共30个循环，反应结束后，由计算机自动分析计算出HBV DNA定量结果及抑制率．HBV DNA抑制率＝[(对照孔拷贝数-实验孔拷贝数)／对照孔拷贝数]x100％。

我已查阅相关文献，但仍有如下问题请教，小弟初次涉及实验，有的问题也许问的不合适，也请各位老师指出，多谢！
1、这个实验的可行性如何，请做过相关实验的老师指点；
2、PBMC的培养是否需要刺激剂（IL-2或PHA）；
3、PBMC和HepG2.2.15细胞的培养条件和培养基是不一样，怎样解决 共培养的问题；
4、药物血清的浓度怎么来确定，可否直接用药物煎剂进行实验；
5、是否要进行药物对细胞毒性试验；
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发表于 2012-3-7 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么没有人回答，是不是问题问的不好，还是做这方面实验的人少，期待各位的关注，多谢！
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发表于 2012-3-7 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个实验设计有漏洞,T细胞发挥效应,必须要有MHC分子存在,而你的肿瘤细胞和病人的MHC类型情况你不知道,肿瘤MHC分子的表达情况你不知道,所以即使发生了细胞毒性效应,也等同于排斥反应.
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 小中大
多谢指教！
因PBMC取自CHB患者的外周血，所以已经经过抗原刺激，经体外再次刺激后用作效应细胞。
请问：肿瘤细胞和病人的MHC类型情况怎样确定，如果是相同的是不是就可以了。如果不行，请问怎样才能弥补。多谢！
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发表于 2012-3-7 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

经请教免疫老师之后，又发现一个问题，就是APC。PBMC中APC是很少的，因此，要先培养DC，然后，再一起培养。这样的话，培养的难度大大加大了，也不知道能不能行得通，希望有过这方面经验的战友多多指点！
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发表于 2012-3-7 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再次补充：患者PBMC和HepG2.2.15细胞进行配型，选择HLA同型的进行实验，已得到老板的赞同和支持，多谢parrot 战友！
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 小中大
修改后的实验，请各位审查：

目的：健脾方刺激后PBMC对HepG2.2.15细胞病毒的清除作用
步骤：
1.制备含药血清，备用
2.进行含药血清的细胞毒性实验，确定合适的细胞浓度
3.分离外周血单核细胞，培养DC
4.分离外周血单个核细胞（PBMC）
5.传代培养HepG2.2.15细胞
6.PBMC与HepG2.2.15细胞HLA配型，取同型的进行以下实验
HepG2.2.15细胞与DC接种于24孔培养板，培养24-48h后，加入PBMC共培养，并加入含药血清培养液，进行干预，之后每三天换液一次，并留取培养上清，-20℃保存，9日后收获培养上清后，同时提取细胞内HBV DNA，按基因组DNA抽提试剂盒说明书进行，所有标本于-20℃保存待测。
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