[资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得

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标题:[资助]分离外周血淋巴细胞---方法＋心得

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。

我的经验
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
4. 离心 .转速：1500/分
温度20c －28c
时间：20分钟
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)
5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。
8 离心。转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)
时间：10分钟
温度：4c
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？
11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形
d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
e 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2
25－50u/孔后，放入培养箱.

建议;
不同厂家生产的淋巴细胞分离液，密度不同。所以第一步离心的转速也会有所不同。最好是按照说明书摸出最合适的转速，这是分离成败的关键！！！！！！。
我用的是eppendorf离心机，上海xx所的淋巴细胞分离液（名字忘记了）效果比较好。不推荐使用北京夏斯的细胞分离液，连个说明书都没有，而且分离得到的细胞中，血小板会很多.

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图1 发亮的为刚分离的pbmc
黑点为血小板
（分离的结果很不好，全是因为该死的“吓死”的分离液

附件

2012-3-7 15:11

59626894.jpg (37.31 KB)

mickeylin[使用道具]
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小中大

还有一张

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2012-3-7 15:11

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小中大

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发表于 2012-3-7 15:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.等倍稀释血液的目的是什么?要获取血浆,在分离后的最上层是血浆和稀释液;
2 是否可以考虑把抗凝血直接加到淋巴细胞分离液;或先离心获取血浆后,再等倍稀释后分离!哪个方法更好?

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-3-7 15:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了pbmc 的经验很受启发，我不是做pbmc分离的，但曾经用过淋巴细胞分离液，谈几点体会，希望能共同提高！
1、因为吸取上层血浆的时候很容易打乱层次结构，离心后我一般直接用吸管伸入中间层吸出所需细胞，然后再吸血浆，如果与淋巴细胞分离液交界处变混浊，少吸一点就是了，反正血浆多得是
2、吸取细胞的时候尽量不要吸到下层的淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液的比重比淋巴细胞大，用离心的方法是不可能去除的
3、重悬细胞的时候不要用含血清的培养基，因会使细胞粘附成团

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非常感谢主任的建议，但是小弟这样做证明
利用离心是可以把细胞与分离液体分开的。我也培养结核杆菌，它门就是漂浮在培养液的上面，膜状生长，但是我通过离心，就能把细菌集结到管底，当然这就需要很高的转速和较长的时间。实践证明我这样做是有用的。还有个明显的证明就是，你把第一步离心的速度加大试试看，到2500以上，可能所有的pbmc都会沉到分离液的下面。
至于吸取血浆，我是这样考虑的：少吸取一点，不要为了吸取血浆把层次搞乱了。这样吸血浆内就不会混有pbmc。

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小中大

我分离的细胞好象数量不太好，生长也不好，怎么回事？？

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小中大

1 发亮的为刚分离的pbmc
黑点为血小板
（分离的结果很不好，全是因为该死的“吓死”的分离液

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首先想请教一个问题，“吓死”的分离液？源何称‘吓死’？
其次，你这两张图片放大倍数是多少呢？4X10 ？并且好象有点不是很清楚，我记得我拍的一些PBMC亮度感比你的好象好一些，细胞与非细胞的对比度也清楚一些，所以我想知道是你仪器问题还是操作问题呢，比如，细胞悬液中有泡漠还是其他？
最后，你判断黑点为血小板依据是什么？通过离心和其他办法能否将以上这些小黑点尽可能的去除呢？

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小中大

我也有分离过pbmc,觉得分离液的品质很重要，我用过三种牌子的（具体记不得了），但是差别的确很大。

有的一边加抗凝全血，一边就有大量红细胞“哗哗”往下掉，这种分离的结果必定很差：大量的红细胞“穿越”分离层，等于打通了一条“隧道”，让所有的细胞通畅无阻的沉到管底，自然达不到依据细胞密度不同，分离pbmc的目的。

好的分离液，应该是加3－4ml后，才有少量红细胞，“一粒粒"，慢慢往下落。红细胞比重大于分离液，“着个"沉到管底，这样不会打破分离层的完整性，分离效果自然很好。

至于，血小板多的问题，如果pbmc得率差别不大，是不是个体差异呢（有些人血小板就是多一些），换个人再试试吧。

66小飞侠[使用道具]
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小中大

有没有在继续分离T细胞和B细胞的方法？

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