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标题:[求助]血管粘附分子检测

kuaizige[使用道具]
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[求助]血管粘附分子检测



作人血管内皮细胞体外培养,观察某种药物是否具有抗炎作用,想检测血管内皮粘附分子 ICAM-1,VCAM-1,Eselectin
我的问题是:
1.因为经费问题,只选择ICAM-1,VCAM-1,Eselectin其中一两个指标,大家通常会选择哪一个?
2.打算用Western和ELISA检测粘附分子,用细胞上清液作可溶性血管内皮粘附分子ELISA检测,可不可以?另外作Western时,抗体选择大家一般从哪家国内公司购买使用效果可靠?

问题有些多,谢谢大家。
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chuntian1983[使用道具]
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问题1:会选择ICAM,E-selectin.因为E-selectin是内皮细胞早期表达的黏附分子,而ICAM的表达在其之后,这样如果做这两样分子,可以观察内皮的早期活化和持续活化。之所以不选择VCAM,是因为我曾经作过ECV-304内皮细胞,居然根本不表达VCAM-1。
2. ELISA方法可以,我作过,试剂盒是Diaclone. Western试剂一般购自Santa Cruz公司。
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kuaizige[使用道具]
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问题1:会选择ICAM,E-selectin.因为E-selectin是内皮细胞早期表达的黏附分子,而ICAM的表达在其之后,这样如果做这两样分子,可以观察内皮的早期活化和持续活化。之所以不选择VCAM,是因为我曾经作过ECV-304内皮细胞,居然根本不表达VCAM-1。
2. ELISA方法可以,我作过,试剂盒是Diaclone. Western试剂一般购自Santa Cruz公司。

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万分谢谢,对我帮助很大。
你做过原代的脐静脉内皮细胞的粘附分子吗?还有哪些经验或应注意哪些问题?
我想买那种进口分装的试剂盒,为了省些经费,但心里又没底。一些文献上大多作细胞的粘附分子 ELISA方法检测,是不是做上清中可溶性粘附分子 ELISA方法检测也可以说明内皮细胞激活?
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chuntian1983[使用道具]
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不好意思,我不经常在网上,所以没有及时回答您的问题。我培养过原代脐静脉内皮细胞,但因为原代培养需要生长因子,而且细胞数量也达不到实验要求,所以我们大部分实验用的都是ECV-304。如果你有原代细胞,且细胞的代数没有超过10代,我想是最理想的实验模型。至于国内分装的试剂盒,我做过精美分装的白介素检测试剂盒,还可以,但不知道黏附分子的检测效果怎样。但他们有试剂方面的技术支持,你可以通过代理商询问电话,然后问一问。另外,上清中可溶性粘附分子 ELISA方法检测当然可以说明内皮细胞激活。我查过文献,国内有人作过烧伤病人血清对培养内皮细胞黏附分子分泌的影响,检测的就是上清中黏附分子(VACM)的影响,文章发表的是国外的杂志,你可以查一查。
Expression and regulation of vascular cell adhesion molecule-1 in human umbilical vein endothelial cells induced by sera from severely burned patients.
Chen XL, Xia ZF, Wei D, Liao HG, Ben DF, Wang GQ.
Crit Care Med. 2004 Jan;32(1):77-82.
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同志门注意啦,目前国外已经不把ECV-304看作是单纯的人内皮细胞株了,因为其中混合有相当数量的肿瘤细胞,因此目前已经再不能用ECV-304作为研究内皮细胞的模型了。具体可以采用以下方法;
1:用脐静脉分离作原代培养。这种原代细胞也有一定的局限性,因为在研究动脉粥样硬化方面,其功能与动脉粥样硬化好发部位的血管内皮细胞功能上有很大的区别,这也可能是有些研究人员在ECV-304检测不到VCAM-1表达的原因之一。
2:最理想的是选用动脉血管的内皮细胞,目前一些国外著名的公司如Clonetics,Promocell Inc等都提供原代的动脉血管内皮细胞,但这种细胞必须用相应公司的添加有多种细胞因子的条件培养基,价格较贵。
3:关于粘附分子的检测,细胞培养上清中可以应用ELISA方法检测,细胞表面表达量可以应用ELISPOT检测,胞浆可以应用Western Blot检测。
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kuaizige[使用道具]
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多谢楼上两位群友的热心相助,强烈要求版主加分。

还有两个问题:
1.如果应用原代脐静脉内皮细胞,作ELISA和WESTERN的时候,至少需要多少细胞?
2.我观察某种药物是否有抑制作用,打算用上述两种方法来做粘附分子检测,是不是就可以说明问题了?还需要继续用别的方法吗?我的细胞培养上清液中是含有药物的,对结果应该不会有影响吧?
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chuntian1983[使用道具]
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ELISA 可用24孔板,上清0.5ml.做Western,如果采用发光试剂盒,可用6孔板的细胞, 但由于不同蛋白的表达丰度不一样,具体的就要摸条件了.药物一般不会影响ELISA检测结果.
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我建议做ICAM,这个我做过,结果很好的,我也是加药物干预了,对结果的影响不是很大,文章已经发表了
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kswl870[使用道具]
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请问有谁检测过大鼠海马部位的神经粘附分子啊,我想检测这个指标,不知有哪位大侠做过,请给我指点。。。。
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jkobn[使用道具]
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前辈你好,我也正有这方面的疑惑。我们实验室也是用PMA,Ionomycin和Brefeldin A体外刺激PBMC后CD4丢失。步骤也是先染表面再固定破膜,最后标记IL-17。所以我们只有通过染CD3和CD8来反圈CD4。我也看到文献上有直接染CD4和IL-17,不知是不是我们在一些小的细节有问题。烦请前辈将具体的protocol附上,不胜感谢!

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请问有:抗人RORc,RORα,Foxp3,IRF4, STAT3 ,BATF 抗体没?我想做一个预实验,如果有的话可不可以分装一点。(有偿),谢谢了
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