细胞世界

PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后CD4和CCR6等表面抗原并不会下调。
检测时这些表面抗原荧光信号下调很可能是你标记抗体步骤不正确。
标记抗体方法：
1、收集细胞后先标记表面抗原的抗体。
2、固定细胞
3、打孔细胞。
4、标记IL-17的流式抗体。
注意表面抗原的抗体标记必须在固定细胞之前。

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前辈你好，我也正有这方面的疑惑。我们实验室也是用PMA，Ionomycin和Brefeldin A体外刺激PBMC后CD4丢失。步骤也是先染表面再固定破膜，最后标记IL-17。所以我们只有通过染CD3和CD8来反圈CD4。我也看到文献上有直接染CD4和IL-17，不知是不是我们在一些小的细节有问题。烦请前辈将具体的protocol附上，不胜感谢！

PMA、Ionomycin和Brefeldin A体外刺激后CD4和CCR6等表面抗原并不会下调。
检测时这些表面抗原荧光信号下调很可能是你标记抗体步骤不正确。
标记抗体方法：
1、收集细胞后先标记表面抗原的抗体。
2、固定细胞
3、打孔细胞。
4、标记IL-17的流式抗体。
注意表面抗原的抗体标记必须在固定细胞之前。

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我又在版内搜到了前辈的其他帖子关于回复Th17的流式检测的。用胞内染色法检测。
一、刺激细胞使其合成IL-17。
二、最后6小时加BFA阻断高尔基体，使合成的IL-17不分泌储存在细胞内。
三、收集细胞，标记表面标记（CD4）。
四、固定细胞。
五、打孔细胞。
六、标记荧光素偶联抗IL-17抗体。
七、流式上样检测。
有几个疑问：
1、我们用的刺激时间是4-5小时，最后2小时加入BFA（许多文献也是这么做的）。不知这里第一步中的刺激时间是多久？
2、固定细胞和打孔的试剂哪个公司的？BD的专门胞内因子检测的试剂么？还是其他的？具体的孵育时间？如果用的是eBioscience的做Treg的破膜固定剂是否有影响？
如果前辈做过这方面的实验，能给一份详细的protocol分享给我们初学者，将不胜感谢！

1、刺激时间可长可短，但是加BFA的时间2个小时有些短，可能导致细胞内IL-17储存不够而得到假阴性的结果，所以加BFA的时间最好是5至6个小时，时间长了对细胞就有毒性。我看过的文献基本上也是控制在这个时间，不知道你说的文献中只用2个小时是哪些文献，我还没有看到过只用2个小时的。
2、我印象中测Foxp3的固定剂和buffer与一般的胞内染色法所用的试剂不一样，建议你不要使用这个试剂盒的固定剂和打孔剂。你用一般的固定剂和打孔剂（胞内染色用）就可以，这些你可以向公司咨询。

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感谢回复！两篇文献，1是用BFA两个小时的，2是用三个小时的。
关于胞内因子的固定打孔剂我知道BD公司有配套的，但是不知道其他公司有没有经济一点的。另外还有一个问题：如果用naive T在Th17极化条件下分化后检测Th17。那我是否还需要标记CD4？