[求助]关于凋亡细胞的凝胶电泳检测

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标题:[求助]关于凋亡细胞的凝胶电泳检测

ffooll[使用道具]
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发表于 2012-3-8 08:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在正在建立凋亡细胞的凝胶电泳检测方法，可是几次实验的结果都不是很理想，我所以参考的方法是卢圣栋编著的分子生物学实验技术一书中记载的方法，但是结果不是根本检测不到]就是荧光太弱，看不太清。附加的是我用数码相机拍摄的最近一次电泳的照相结果。第二道好象有凋亡的ladder，如何才能使每次的荧光强度增高呢？我试过了增加EB的量和浓缩样品，加大上样体积都收效不大，是不是在样品处理收获DNA时应该注意些什么呢？第二道究竟是不是凋亡的LADDER呢？这种图象是不是可以达到发表要求呢？

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2012-3-8 08:25

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发表于 2012-3-8 08:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感觉你的样品凋亡率不是很高，我参照的是黄培堂编译的那本细胞实验指南（冷泉港），和各种形形色色的方法比，最大特点就是不用酚氯仿抽提，而是Rnase和蛋白酶K消化后，直接点样电泳，这样做效果不错，你可以试试，再就是低电压。我以前试的那些方法我是没有做出来的！国内的书大概只是用来看的吧。

ffooll[使用道具]
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发表于 2012-3-8 11:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想请教楼上，我也曾按照您所说的方法做过，但是加样时太粘稠了，怎么也加不进，还请从您的经验指导一下，有关用这个方法做凋亡所需要注意的地方。多谢赐教！

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发表于 2012-3-8 14:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，你看来也是那本书的读者，但是你应该注意到那本书所讲的，加样应在干孔中加，就是电泳槽没有上缓冲液之前加样，其实那本书所提示的每一小点都有它的作用，注意事项我不敢谈，好像也没什么特别的，如果对样品的凋亡程度信心不足的话，冷冻抽真空浓缩一下可能效果更好，不谢，希望你能顺利解决战斗，也希望破除DNA ladder难做的迷信，毕竟我也被这个东西折磨了老大一段时间，以为那些经典方法才是最好，其实抽来提去的，fragment早都丢完了，鄙视那些经典。

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-3-8 14:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

唉，我也为该选哪种方法而苦恼啊！
但现在一个问题是SDS加入溶液后，溶液变浑浊，始终不能溶解，不知道是怎么回事啊？

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发表于 2012-3-8 14:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你是加固体吗？！配成10％的SDS(pH8.0)，临用前加入裂解液(pH8.0)(final concentration 0.2-0.8%).

Ao7[使用道具]
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发表于 2012-3-8 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也用此种方法做过了,其实这种方法的效果还是比所谓苯酚抽提法好一些又省力省东西.

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-3-8 14:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是直接加的SDS粉末的，具体配制过程如下：
我是按照cell(1996)上一篇paper上配方NaCl:0.2M, EDTA:5mM, Tris-Cl:100mM(pH=8.5), SDS:0.2%(w/v)。我首先加tris-base然后搅拌溶解，然后再加NaCl搅拌溶解，然后在加EDTA溶解，此时溶液清澈，然后再加SDS，但溶液很浑浊，搅拌了很久还是很浑啊？难道必须首先配好各自的溶液，然后再混合那？
另：是不是配好溶液调PH值呢？还是等tris-base溶解后就调PH值呢？

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发表于 2012-3-8 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，谢谢诸位兄台不吝赐教，不过，依照你的方法在干孔加样时，将胶放进缓冲液中后总有一些会被液体浸泡出来，不知有何解决方法？另外你提到细胞的凋亡率不是很高，我在细胞收集的时候应用的是胰酶消化，是不是对结果有影响。是否有其他更好的细胞收集方法呢？

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发表于 2012-3-8 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我查阅文献后也有和您同样的感觉，采用传统的DNA抽提后小片断肯定会损失不少，所以我就采用这个改进的方法，但是试过后还是没有出结果，看来我看书还是不细。我也有和楼上兄台同样的问题，就是干孔加样后再将胶放入电泳槽后，原来加入的东西会漂出来，所以还请您多指教！

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