细胞世界

我用的TritonX100的方法，不过好像抗体都没有进去。用的1%的多聚甲醛固定，不知道是不是固定不够 还是打孔没有打好。

————————————————————————————————————————————————————

1. 2%PFA（PBS配制)固定1小时，冰浴
2. 离心，弃上清，重悬细胞后，PBS（含1%BSA)洗细胞1-2次
3. 0.1%saponin(pbs配制）+1%BSA 15分钟 冰浴

4. 离心弃上清，不洗，重悬细胞，染色40分钟，冰浴~

5. 0.1%saponin(pbs配制）+1%BSA 洗细胞3-5次
6. 加1%PFA，上机检测（注意，如果采用的是复合燃料PECY5.5等，必须在1小时以内检测，否则荧光变化很厉害）
7. good luck

各为高手，请教一下，本人做人外周血单个核细胞的IL-17，也是由于流式仪使用时间的限制，要在刺激，阻断后，第二天，才能检测，我在坛子里看到有前辈建议“对于6小时的protocol，一般采用较多的是在刺激2小时后加入BFA 和Monensin来阻断高尔基体功能，刺激因子的表达，使合成的Intracellular Cytokine能留在细胞内部分必到细胞外，才可以由经Intracellular Cytokine Staining检测到。
阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用。 ”

我有一点不明白，（阻断后再培养4小时可以把细胞放进4度冰箱留待染色用），是带着刺激，阻断剂一起就放在冰箱里，不需要离心，清洗等处理后再4度保存吗？在保存的时间里，刺激，阻断剂不会对细胞造成影响吗？

问题比较傻，请大家不吝赐教，谢谢

————————————————————————————————————————————————————————————————

谁说的培养后可以把细胞放进4度冰箱留待染色用的？你想留待多长时间？放在4度冰箱细胞是会死的，是会严重影响你的实验结果的。做实验时要安排好时间，根据流式检测的时间合理安排好刺激的时间，染色所需要的时间，尽量缩短细胞收集到检测时的时间。
另外，细胞放到4度冰箱后细胞的新陈代谢会大幅度下降，刺激剂和阻断剂等基本不会影响细胞。