小中大个人做凋亡参考的一篇文章，觉得不错，转贴供参考
制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：
a) 没有染色的细胞;
b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;
c) 仅用PI染色的细胞.
1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。
注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。
2.建立LogFL1-LogFL3双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。
3. 检测annexin V-FITC单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1的荧光被FL3 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1漏到FL3荧光的补偿%（这可能在1-5%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL3的阳性信号，此时要降低FL3 PMT的电压。
4. 检测PI单染的细胞并检查FL1-FL3散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI的荧光被FL1 PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL3漏到FL1荧光的补偿%（这可能在15-25%之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1的阳性信号，此时要降低FL1 PMT的电压。
5. 如果在以上调节补偿过程中更改了PMT的电压，我们建议重复3、4步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。
6.因为许多未处理的细胞群体中存在一定数量的annexin V和PI双阳性的细胞，运用annexin V试剂盒来检测凋亡必须从处理过的细胞中扣除这些原本就存在的双阳性细胞。
7.根据未处理细胞或对照细胞经annexin V和PI染色后在流式细胞上分析的结果来设定十字门的位置，FL1和FL3的划定方法如下：
a. 设定FL1标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是annexin V染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1轴方向上升至2个对数坐标值）。将垂直的FL1标尺设定在紧靠annexin V阴性群体右侧0.1-0.2Log单位的地方。b. 设定FL3标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log单位的地方。理想中，以上介绍的设门方法可以适用于任何细胞群体来设定十字门的位置。
8. 经处理过的细胞此时可以用annexin V 和PI染色后在流式细胞仪上分析。那些在在阴性群体门以外的细胞可被识为annexin V或annexin V和PI阳性的细胞。
