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标题:[求助]请问用RIPA裂解液提取蛋白，离心后为什么会出现...

+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2012-3-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]请问用RIPA裂解液提取蛋白，离心后为什么会出现...



我在用RIPA裂解液提取肠上皮细胞蛋白，操作流程如下：
1、弃去六孔板中的培养基
2、用PBS冲洗三遍，最后一遍吸干净（PBS 4℃预冷）
3、裂解液200ul/孔，冰上30min，每5分钟震荡一次
4、细胞刮刮取（细胞刮用前无水乙醇浸泡，晾干后使用）
5、转移至EP管中，12000r/min，10min，4℃
6、取上清分装

就是在第六步，取上清时，发现里面有像鼻涕一样的物质出现。。。。
PS：
我使用的1ml裂解液中加入10ul的PMSF，
求各位大神指点，小弟感激不尽！！！
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49888[使用道具]
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发表于 2012-3-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也出现过同样的问题，这种物质可能是细胞核内DNA的释放造成的，试试看下面的方法：

1.减少裂解液用量，同时刮细胞时尽量减少刮得次数使被机械性破坏的细胞减少

2.加入DNA酶

3.提完蛋白后，如发现黏黏的东西，把蛋白在95读孵育10分钟，然后立即冰浴5分钟

祝好运！
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发表于 2012-3-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接去超声就好了~~~应该是蛋白质~~
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wsll[使用道具]
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发表于 2012-3-10 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

六孔板每个孔只加200μl？液面应该不能完全超过细胞层吧。可以试试下面的方法：

六孔板去两个孔的细胞，PBS洗三次，胰酶消化，取细胞转移至EP，PBS洗两次，再加入200μl的裂解液（含PMSF），手指轻弹混匀，冰上作用10-20min；4℃，12000rpm离心10min，收集上清即为细胞总蛋白。

可加入上样缓冲液跑SDS-PAGE。
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发表于 2012-3-10 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
六孔板每个孔只加200μl？液面应该不能完全超过细胞层吧。可以试试下面的方法：

六孔板去两个孔的细胞，PBS洗三次，胰酶消化，取细胞转移至EP，PBS洗两次，再加入200μl的裂解液（含PMSF），手指轻弹混匀，冰上作用10-20min；4℃，12000rpm离心10min，收集上清即为细胞总蛋白。

可加入上样缓冲液跑SDS-PAGE。

————————————————————————————————————————————————————————————————

这样的话，岂不是不用种板也可以？直接消化培养瓶里的细胞就可以了？是不是这样？还有，我加200ul裂解液发现提得蛋白浓度比较低，不知道是不是可以降低裂解液的用量？请指点，多谢
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发表于 2012-3-10 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接去超声就好了~~~应该是蛋白质~~

————————————————————————————————————

我们实验室没有超声的。。。蛋白质为什么会这么粘稠？我都弃掉了。。。唉
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-3-10 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很小的注射器反复吹打~~~~试试看~~注意温度~~再要不就用1*loading buffer提蛋白，配方忘了~~到网上找找吧~~ good luck~~
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发表于 2012-3-10 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
六孔板一个孔的细胞用200μl裂解浓度应该不算低，反正WB是够了，当然用100μl应该也可以，只不过我没这么干过。不知道你要高浓度的蛋白做什么实验呢
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+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2012-3-10 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 qqq111 的帖子

做western blot。。。。
我有一个同学实验室直接用100cm2的培养瓶提蛋白，用的方法是：

1、弃去培养瓶中培养基
2、用PBS冲洗三遍（PBS 4℃预冷）
3、加入1mlPBS，细胞刮刮取（细胞刮用前无水乙醇浸泡，晾干后使用）
4、转移至EP管中，1000r/min，10min
5、弃上清，加入1mlPBS,1000r/min，10min
6、加入裂解液80-100ul，冰上30min，每5分钟吹打一次
7、转移至EP管中，12000r/min，10min，4℃
8、取上清分装
这样一比较的话，我们之间用裂解液的量的差距也太大了。

有可能是目的蛋白的浓度不一样吧？我是初学者，还弄不很明白。

另外，我做western blot的条带清楚，但是比较浅，不知道是什么原因，请指点
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-3-10 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

比较浅？是显色的问题吧。也可能是上样量少了点
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