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标题:[求助]关于原代细胞培养的消化问题

西子[使用道具]
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[求助]关于原代细胞培养的消化问题




组织采用胶原酶消化后,有两种方法:一是取消化的溶液(也就是未消化的组织以外的溶液),然后离心,得到细胞,直接培养。二是消化的整个溶液,直接离心,沉淀就是细胞和未消化的组织。两种方法如何选择。我采用第二种方法,贴壁后显微镜下观察,组织的中央有些黑色的东西,不知道是胶原虫,还是霉菌。如果采用第二种方法,有什么办法改进?
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可能是消化后组织坏死的残渣,消化后,用200目的铜网过滤
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milkdog[使用道具]
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是不是消化的整个溶液,不离心,直接用200目的铜网过滤?直接用200目的铜网过滤,那些未消化的组织就被拦截了,而下来的细胞很少啊,很难获得更多细胞啊,我想问下第二种方法是不是酶消化结合组织块法?
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组织剪切成0.5-1毫米的组织块,按组织的消化,一般消化15至20分钟,消化是要轻轻摇动,目的是消化充分;肉眼观察消化液变浑浊,组织相互粘连,终止消化,取细胞悬液用200铜网过滤;剩余组织残渣可再加消化酶消化,这时一般消化5至10分钟,按上面同样方法过滤;最后的组织残渣可冲洗(如果细胞易取的话或不冲洗,直接丢弃),收集冲洗液过滤。收集细胞悬液离心,取沉淀,PBS吹打,再离心;取沉,加培养液,第一次细胞接种密度要高。

注意:组织残渣是非常多的,实际上细胞已消化下来,若果继续消化,消化下来的只是组织碎片,消化过度会使细胞消化成碎片。
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原代细胞要培养的好,先要过细胞提取这一关,不要心急,要根据实验室条件慢慢摸索,会成功的。祝你好运!
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你可上“生物谷”,“生物秀”这两个网站。
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组织采用胶原酶消化后,有两种方法:一是取消化的溶液(也就是未消化的组织以外的溶液),然后离心,得到细胞,直接培养。二是消化的整个溶液,直接离心,沉淀就是细胞和未消化的组织。两种方法如何选择。我采用第二种方法,贴壁后显微镜下观察,组织的中央有些黑色的东西,不知道是胶原虫,还是霉菌。如果采用第二种方法,有什么办法改进?

我有点疑问,想问一下楼主:

1.楼主消化时什么组织,前人用什么方法消化,能否作为参考?

2.采用第二种方法你想得到什么,或者说这种方法获得的细胞是活力比较高还是数量多等?

3.你说的贴壁后,是什么贴壁后,细胞or组织还是细胞组织混合物?

4.组织中央的黑色东西为什么怀疑是胶原虫或者霉菌之类,有没可能是其它东西,比如血块或细胞聚集成簇?还是说是污染后你发现有黑色的东西,然后怀疑是胶原虫或者霉菌之类的污染?

其实,我个人认为你说的两种方法并不是绝对的对立,首先你要清楚如果选择第一种方法,那麽它致命的缺点是什么,这种缺点能否改善,这种缺点是否会导致你的结果很差;如果选择第二种方法,那麽优缺点又是什么;这两种方法能否联系起来,其实方法都是前人建立的,你也可以建立起适合你们实验需要的方法的,不一定完全照本宣科的,你说呢
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谢谢你!你讲得很详细,我目前正在试验,和你说的方法差不多,我换了胶原酶消化,消化液有细胞,然后直接过滤(200目),我只消化了一次,我把消化液加大了,因为我用的是老年大鼠,所以本来细胞的活力就不强了,也试着第一次把细胞接种密度加大,希望这次能有所改善。我也以为那黑色的物质是死的组织团块。
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我有点疑问,想问一下楼主:

1.楼主消化时什么组织,前人用什么方法消化,能否作为参考?

2.采用第二种方法你想得到什么,或者说这种方法获得的细胞是活力比较高还是数量多等?

3.你说的贴壁后,是什么贴壁后,细胞or组织还是细胞组织混合物?

4.组织中央的黑色东西为什么怀疑是胶原虫或者霉菌之类,有没可能是其它东西,比如血块或细胞聚集成簇?还是说是污染后你发现有黑色的东西,然后怀疑是胶原虫或者霉菌之类的污染?

其实,我个人认为你说的两种方法并不是绝对的对立,首先你要清楚如果选择第一种方法,那麽它致命的缺点是什么,这种缺点能否改善,这种缺点是否会导致你的结果很差;如果选择第二种方法,那麽优缺点又是什么;这两种方法能否联系起来,其实方法都是前人建立的,你也可以建立起适合你们实验需要的方法的,不一定完全照本宣科的,你说呢

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谢谢,现在第一种方法已经否决了,组织培养太慢,老年鼠即使能养出来,也没有活力。我的组织是膀胱,查的文献绝大部分是我说的第二种方法酶消化结合组织块法,采用第二种方法,我个人认为目的是同时得到细胞和未消化的组织(未消化的组织采用酶消化后变得松散,这样有利于细胞爬出),这仅仅是我个人的理解。贴壁是指细胞组织混合物。组织中央的黑色东西我现在觉得应该是死的组织团块,或者是剔除粘膜没有彻底清除。所以我觉得第二种方法最致命的缺点是有黑色东西,而且影响细胞的生长。我用第二种方法,同一天做,有时候有,有时候没有,所以排除了是试剂的原因。所以现在我换了酶,使细胞尽可能多点,然后过滤。目前正在观察。采用消化法,个人觉得最重要的是选择何种酶,浓度及消化时间。
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西子[使用道具]
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谢谢你!你讲得很详细,我目前正在试验,和你说的方法差不多,我换了胶原酶消化,消化液有细胞,然后直接过滤(200目),我只消化了一次,我把消化液加大了,因为我用的是老年大鼠,所以本来细胞的活力就不强了,也试着第一次把细胞接种密度加大,希望这次能有所改善。我也以为那黑色的物质是死的组织团块。
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