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标题:[求助]HUVEC的细胞迁移模型

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]HUVEC的细胞迁移模型



各位大侠，谁做过VEGF诱导的HUVEC迁移模型？

HUVEC 按正常的程序培养 （5% FBS + ECGS supplement +ECM 内皮细胞培养基 ），使用第3-5代的细胞

我用Corning的transwell, transwell小室的polycarbonate membrane未经包被。 下室的VEGF浓度从2-40 ng/ml 不等， 诱导迁移过4h， 24h。

迁移完后将小室放到一块新的24孔板，胰酶消化， 加Calcein 钙黄绿素检测荧光。

最后发现未加VEGF的样品与加VEGF诱导迁移的样品荧光强度差不多。不知道问题出在哪里？

是不是小室的polycarbonate membrane需要包被？ 用什么包被？　collagen, fibronectin？　包被小室的内表面？　　外表面？　

请各位指点。　　感激！　
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你为何要消化？如果不消化把未能穿过的细胞擦掉，把穿过的细胞用Calcein 钙黄绿素染料后检测荧光试试吧。
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发表于 2012-3-12 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你为何要消化？如果不消化把未能穿过的细胞擦掉，把穿过的细胞用Calcein 钙黄绿素染料后检测荧光试试吧。

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不消化可以直接用Calcein染色？ 可以直接检测荧光？ 是否需要消化下来？　另外，ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的聚碳脂膜是否需要包被？　包被哪一面？　
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.迁移完之后用CALCEIN标记一小时，再消化下来测荧光值

2.也可以标记后将膜上层细胞用棉签擦干净，用荧光显微镜先观察一下再消化测荧光值

3.包不包被是无所谓的，HUVEC贴壁很好。

4.但是细胞量一定要够，至少50000，一般200000迁6小时吧，50000的话延长时间比较好。

迁过去的细胞量是和种的细胞量以及时间成正比的。

BFGF加10NG足以，VEGF没用过，估计也差不多
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3.包不包被是无所谓的，HUVEC贴壁很好。
4.但是细胞量一定要够，至少50000，一般200000迁6小时吧，50000的话延长时间比较好。
迁过去的细胞量是和种的细胞量以及时间成正比的。
BFGF加10NG足以，VEGF没用过，估计也差不多

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谢谢指点。 还有几个问题：包被的目的是什么？ 如果包被，包被上面还是下面？
对了，你用的transwell小室是哪个公司生产的？ 能否分享你的迁移实验protocol给我？
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜上包被的目的是使细胞钻过来后更容易贴壁，膜上包被的话是用于侵袭实验，单纯迁移的话可以不包被

我用的是MILLIPORE的TRANSWELL。

前面迁移的步骤园子里有，都差不多
迁移完之后用一块新24孔板，每孔加600微升CALCEIN（4微克每毫升），将篮子放进染色1小时，再消化下来，测消化液的荧光值就可以了
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-12 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
膜上包被的目的是使细胞钻过来后更容易贴壁，膜上包被的话是用于侵袭实验，单纯迁移的话可以不包被

我用的是MILLIPORE的TRANSWELL。

前面迁移的步骤园子里有，都差不多
迁移完之后用一块新24孔板，每孔加600微升CALCEIN（4微克每毫升），将篮子放进染色1小时，再消化下来，测消化液的荧光值就可以了

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如果包被膜上面，就是做侵袭；如果包被下表面就是做趋触。 许多文献报道的HUVEC迁移模型，以VEGF或bFGF诱导，都是用fibronectin包被的，但是不清楚是包被哪一面。 如果我就是用VEGF诱导HUVEC的迁移模型， 是否也算趋触？ 迁移和趋触地区别是什么？

你用Millipore的小室还是他们提供的全套的Kit？ 我咨询过Millipore的客服， 他们也没有明确给出建议应该用哪种包被。

一直还没搞明白这个问题。 请指教
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