[讨论帖]免疫细胞或组织化学染色的相关问题

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标题:[讨论帖]免疫细胞或组织化学染色的相关问题

一叶[使用道具]
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发表于 2012-3-13 11:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是大鼠延髓组织冰冻切片，厚15微米，免疫组化实验。片子经铬钒明胶处理，在3％双氧水浸泡，加一抗和二抗及冲洗和脱水的过程中就会出现脱片现象，谢谢交流指点！

glass[使用道具]
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发表于 2012-3-13 11:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

脱片的原因很多，您还是把自己如何制作片子和如何进行组化的简单步骤列出来，好让大家来分析！

一叶[使用道具]
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发表于 2012-3-13 11:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是大鼠延髓组织冰冻切片，DAB作显色剂，检测P物质和CGRP(降钙素基因相关肽）。现在的问题是染色背景太深，而且没有阳性显色，为什麽? 一抗浓度1:100,武汉博士德公司产品。是否显色之后必须要做苏木素复染，什劘条件下作复染，是否要盐酸酒精分色？我的切片从冰箱取出后，我的免疫组化步骤是：（是否合理，参照博士德公司方法)
1。3％双氧水浸洗10分钟，蒸馏水浸洗2－3次，pbs液洗2分钟3次；
2。25％醋酸浸泡10分钟，pbs液洗3分钟3次；
3。擦干，羊血清封闭20分钟；
4。甩干多余液体，滴加一抗，室温过夜；
5。pbs液洗2分钟3次，擦干多余液体，滴加二抗，37度孵育40分钟；
6。pbs洗3分钟3次，擦干，滴加SABC 液，37度孵育40分钟， pbs 液洗5分钟4次；
7。DAB显色；
8。苏木素复染，盐酸酒精分色，自来水冲洗；
9。梯度酒精脱水，80％，95%,无水酒精及分析纯各5分钟；
10。二甲苯两次透明，树胶封片。
这样作可以吗? 需要作那些改进和完善？请大侠学兄给予指点，不胜感激！！
另感谢你的指点，多谢！！

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-3-13 11:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

让我们逐一分析一下下。。。。

1。脱片－－
a）切片和贴片一定要过关；
b）冰冻切片从冰箱中拿出必须复温并凉干（室温1－2h）；
c）清洗切片时应放在切片缸内，沿缸壁倒入PBS，静置5－10min，没有晃动的必要。

2。染色背景太深，而且没有阳性显色－－
a）灌注要要过关；
b）需用3％双氧水甲醇溶液浸泡切片；
c）需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片；
d）延长羊血清封闭时间；
e）降低一抗的浓度；（我有一次就是用了较高的一抗浓度，结果没有染出东西，但是降低一抗浓度后，结果非常好，其实这就是抗体的“prozone”－－前区现象）

3。苏木素复染
个人认为并没有必要！

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发表于 2012-3-13 11:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

附上我们这里的组化步鄹：（切片复温凉干完毕）

1。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MPBS 20ml＋30%过氧化氢 1ml）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

2。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100 1ml＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3；

3。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀释的第一抗体4℃反应24-48h。吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；

4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育2h。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3；

5。加入ABC复合物，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3，蒸馏水迅速冲三次；

6。加入硫酸镍铵溶液（DAB 25mg＋蒸馏水50ml＋硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化铵40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应；

或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脱水之后，二甲苯透明，中性树脂封片。

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发表于 2012-3-13 11:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您之所以没有染出来，可能是没有加triton的缘故！

flower-201[使用道具]
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发表于 2012-3-13 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2012-3-13 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可是我们实验室的实验员说我的不必加Triton, 连丙酮固定都不需要，让我直接加３％的双氧水，然后蒸馏水洗，pbs洗，２５％醋酸浸泡１０分钟，pbs洗，羊血清封闭２０分钟，加一抗，４度过夜，二抗和SABC各４０分钟，DAB显色，８０％，９５％，无水乙醇，分析纯，脱水５分钟；二甲苯透明１０分钟，中性树胶封片。现在结果是没有阳性显色，为什莫？我们的实验员对不对？我是西安医科大学的，请您指点！！！谢谢！
我做的也是大鼠延髓组织的冰冻切片，也有脱片现象，按你的要求做了以后，脱片几乎没有了！！真是高手！！
　　我用的也是武汉博士德产品，检测SP和CGRP,已经摸索了３周了，一直没有结果，迫切需要高手帮助！！！
　　另，PBS浓度是0.02的，不知有无影响？我的步骤准确吗

————————————————————————————————————————————————————————————————

各个实验室都有自己的方法，只要能够出结果，就没有必要去统一。

加不加Triton是和您要染细胞的抗原分布和用途有关：
Triton的作用是在细胞膜上打孔，以便抗体进入！

a）如果要染抗原分布在细胞膜上面，那么就不能加Triton；
b）但是如果抗原分布在胞浆或核内，那加入Triton就显得比较重要（虽然细胞在固定后的通透性较活细胞大，但是还不至于让任何东西都过去！）；
c）另外作电镜时一定不加Triton。

PBS浓度一般是0.01M。

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发表于 2012-3-13 11:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上述组化步鄹是组织切片的，而对培养的细胞则比较简单：（细胞最好种在玻片上）

1。固定液固定10－30min，0.01MPBS清洗2min×3；

2。羊血清封闭液封闭（可以加入0.3% Triton X100 ）30－60min分钟；

3。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀释的第一抗体室温反应1－2h或4℃过夜。吸去抗体，0.01MPBS洗2min×3；

4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育1h。吸去二抗，0.01MPBS洗2min×3；（如果是荧光二抗就可以直接用50％甘油封片，进行观察了）

5。加入ABC复合物，室温孵育1h，0.01MPBS洗2min×3，蒸馏水迅速冲三次；

6。加入硫酸镍铵溶液（DAB 25mg＋蒸馏水50ml＋硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化铵40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应；

或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脱水之后，50％明胶封片。

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发表于 2012-3-13 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PM: 今天的结果不理想。阳性显色不明显，跟背景区别不大。我的一抗1：50，4度过夜26小时，二抗和SABC各37度1小时；pbs洗5分钟3次。前面的步骤按照你提供的方法做的。0.3%过氧化氢甲醇溶液（0.1:10ml，对不对？),0.3%triton-x液浸泡各30分钟。今天的结果有阳性显色，但不明显，与背景区别不大，我下一步该怎么办？请给予指导！！
急盼答复！谢谢！！

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0.3%过氧化氢甲醇溶液(10ml)配制
0.3%过氧化氢：甲醇：0.01MPBS = 0.1ml ：8ml ：2ml

结果不明显的原因分析：
a）一抗浓度问题：不知您的抗体是那一家的，他们的推荐浓度是多少？
b）一抗的效价问题：作一个阴性对照（不加一抗，而其他步鄹一样），看看结果。

一般二抗和ABC问题出的比较少！

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