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标题:[求助]关于CHO悬浮细胞的转染

leifengta[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于CHO悬浮细胞的转染




本人现在正做CHO悬浮细胞的转染，转染试剂为linear PEI 25KD，做了两次了，都失败了！请大侠指教！
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TNT[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是怎么判断转染失败的?你转了绿色荧光蛋白作对照了吗，转染效率有多高，PEI的转染效率不高，最多也就50%左右，一般也就20%左右，转染时细胞状态一定要好，若果死细胞太多，或细胞成团则转染效率低下，质粒的好坏也是一个关键因素，一定不能有内毒素污染，最好是买去内毒素质粒试剂盒提，此外质粒与PEI的比值也对转染有影响，需摸索最佳比值
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我转的是N31-GFP，DNA：PEI为1：5时才能在视野中看到依稀的两三个荧光；质粒应该没有问题，因为我有用该质粒来转染贴壁293细胞。细胞状态也还好吧！
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glass[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你转染时用的是什么培养基，据我的经验转染率的高低次序为1640>DMEM>CD DG44，建议你换用1640基础培养基试试，切记培养基中不能含有抗生素
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你的最大转染效率是多少？
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

20-30%左右
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我太崇拜你了，我现在只能做到5%
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问一下，那你一般怎样把细胞调到最适合转染的状态
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞状态好时在光镜下看着很亮，且背景干净，细胞分散良好，我以前养的DG44细胞，和容易成团，严重影响转染效率，主要是细胞长的太过，一般密度不超过106/ml最好，转染用的细胞传代次数不能太多，一般复苏后传了5-10代之间转染效果最好，所以细胞买来之后要多冻几支，另外还有关键的一点，转染之前要用新鲜培养基洗涤细胞两次，因为一些细胞分泌物或代谢物会影响转染效率
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-3-13 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我转的是cho-k1和cos-1、cos-7等，我首先promega的无内毒素质粒提取试剂盒，全程无菌操作，100ML的质粒最后浓缩成30ml,使用时1ul的质粒，5ul的invitrogen的脂质体，在无血清的mem中混合20分钟，加入转染孔，6-8h后，加入DMEM，我做的是百分之十的PAA，百分之零点五的双抗，48小时换液，含50ug\ml的G418的培养基，等适应后逐渐加大浓度筛选，祝你好运
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