[讨论帖]细胞融合和杂交瘤技术

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标题:[讨论帖]细胞融合和杂交瘤技术

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发表于 2012-3-15 13:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

杂交瘤技术
表2-10 常用骨髓瘤细胞株的特点
名称  全名  特点  来源
SP2/0  SP2/0-Ag14  不产生Ig  BALB/C小鼠浆母细胞瘤
NS-1  P3-NS-1-Ag4/1  产生K轻链非分泌型  BALB/C小鼠浆母细胞瘤
FO  Fast-Zero  不产生Ig  BALB/C小鼠浆母细胞瘤
Y3  Y3-Ag1.2.3  产生K  Lou大鼠骨髓瘤
SKO-007 产生λε  人浆细胞瘤
TM-HZ 产生λK  人浆细胞瘤

骨髓瘤细胞的培养骨髓瘤细胞可用10%小牛血清的RPMI1640培养基以悬浮或半贴壁形式生长繁殖，对于半贴壁细胞无需用胰蛋白酶消化，直接用吸管吹打即可使细胞分散，传代培养要保持细胞的对数生长期，每3～5天传代一次。
用于融合试验前必须做对HAT选择培养基敏感性试验，由于HGRPTase缺损，DNA合成障碍细胞，应发生死亡，否则有变异，不能用于试验。以SP2/0细胞为例，应在筛选建株时应用的8-氮鸟嘌呤致死剂的培养液中(20～30mg/L)培养一代后，换成常规培养基培养。

制备免疫脾细胞悬液：通常在末次免疫后第3～4天以拉颈或断头处死小鼠，用75%酒精浸泡消毒小鼠毛皮。然后打开腹腔无菌取脾，去除脂肪和结缔组织，用无血清的培养液冲洗，置100目不锈钢网筛上研磨脾脏，用洗液洗2～3次，经1000r/min离心5分钟，弃上清加入完全培养基，用吸管吹打分散，收集上层悬液，除去沉下的大块。活细胞计数，一般一只小鼠可获1～2.5×108脾细胞。

细胞融合
聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合法：PEG结构为HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，分子量从小于200至大于6000，均可作细胞融合剂。通常用分子量1000或4000的PEG作融合剂，50%溶液产生最多***细胞，若用分子量较小的PEG时，以55%浓度为好。PEG在pH6.0时细胞融合率最高，融合时细胞密度不要太大，常采用微孔膜过滤除菌，因高压灭菌会产生有毒醛类化学物。具体步骤如下：
(1)  将两种不同亲本细胞以10:1或5:1混匀，即作单克隆抗体杂交瘤细胞融合试验时，取107个免疫脾细胞加入108个SP2/0(或NS1)鼠骨髓瘤细胞，混匀后低速（200g）离心去上清，叩松沉淀细胞。
(2)在37℃水浴中边摇边滴加0.7ml预热的50%PEG(MW1000或4000)，于一分钟内滴完。
(3)于2分钟内加入15ml预热的无血清1640培基，以终止融合，1000r/min离心去上清，沉淀细胞悬浮于24ml HAT培基中。
(4)将细胞分种于含饲养细胞的24孔板中，0.5ml/孔,置37℃含5%CO2的培育箱中培养，每3～4天半量换HAT培养,15天后改用HT培基，3周后改用完全RPMI16403培基。
(5)培养3～5天即可有小克隆出现，杂交细胞较大，呈园形，且透明，其它细胞透光性差并逐渐死亡。
培养8-12天，克隆可长至底面积的1/3～1/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测。
(7)一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转入培养瓶扩大培养，冻存部分克隆细胞，并尽快进行克隆化培养。

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发表于 2012-3-15 13:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

表14-9 细胞融合剂
病毒类  DNA病毒：水痘和疱疹病毒，天花（兔天花）病毒RNA病毒：仙台(HVj)病毒,NDV，腮腺炎病毒,SV5,麻疹及呼吸道合胞病毒RNA致癌病毒：Rous肉瘤病毒，Visna病毒冠状病毒：禽类感染性气管炎病毒
化合物  水溶性：聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、ConA脂溶性：溶血卵磷脂、磷脂酰丝氨酸
生物制剂  昆虫Paederus,fuscipes提取物

细胞性抗原ELISA测定法
1)制备细胞抗原板：先将贴壁生长的细胞消化制成细胞悬液，接种96孔板，200ul/孔(细胞为105/孔)于37℃5%CO2培养24～48小时，弃培养液，用PBS（pH7.2）洗3次，然后用含1%牛血清白蛋白封板，用塑料袋密封4℃保存，2周内可用。
2)检测抗体时，取出检测板。
3)每孔加0.1ml0.3%H2O2-PBS 37℃放置30分钟，以阻断内源性过氧化物酶。
4)PBS洗3次，每次3分钟。
5)每孔加入有克隆形成杂交瘤细胞培养上清液50ul，37℃孵育1-5小时,或4℃过夜。
6)PBS洗2次，洗涤液（PBS中含0.1%小牛血清、0.01%明胶、0.1%牛血清白蛋白、0.05%Tween20和0.01%NaN3）洗2次，每次3分钟。
7)每孔加辣根过氧化物酶标记的兔(或羊)抗小鼠IgG 50ul，[用稀释液（即PBS中含2%正常兔血清和10%甘油）稀释酶标抗体]，37℃孵育30分钟。
8)PBS洗5次，每次3分钟。
9)每孔加新鲜配制的0.1ml底物溶液(邻苯二胺20mg溶于50ml pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，用前加30%H2O2)25℃暗处反应30分钟。
10)每孔加50ml 2mol/L H2SO4，终止反应。
11)判定结果：阴性对照孔应无色，阳性对照孔呈橙黄色，试验孔的颜色与阳性对照孔颜色基本一样，可判定为阳性。此外，也可在酶标仪的490nm波长下测定吸收值。若试验孔的光吸收值大于或等于阳性对照孔的光吸收值，可判定为阳性。

有限稀释法克隆化培养
1）将细胞悬液于HT-1640培养液（含10~15%小牛血清）中计数细胞浓度，然后用该培养液稀释至每毫升分别含5、10和50个细胞的细胞悬液。
例如：假设该细胞混合悬液的细胞浓度为3.5×105/ml，可按如下步骤稀释：
取该细胞悬液0.1ml+培养液（HT）3.4ml-----------104cells/ml(A液)
取A液0.1ml+培养液（HT）9.9ml-------------------102cells/ml(B液)
取B液1ml+培养液（HT）1ml------------------------50 cells/ml(C液)
取B液1ml+培养液（HT）9ml------------------------10 cells/ml(D液)
取D液2ml+培养液（HT）2ml-------------------------5 cells/ml(E液)
2)将上述稀释的细胞悬液C、D、E分别加入含有饲养细胞的96孔培养板的小孔中，100μl/孔，使每孔分别含有0.5、1和5个细胞，这种细胞的分布率，常常根据细胞的特性和试验条件而有所不同，对于生长良好的细胞，其分布密度（分布率）可以适当低一些，对于刚融合后的第一次阳性克隆筛选时，孔中的细胞密度要求高一些。
3）培养板在5%CO237oC下培养至第3~4天，在显微镜下，可观察到单细胞增殖情况，（培养当天或第二天板的U型底中开始为单细胞分布，第3~4天细胞数明显增多）。
4）特异性抗体检测，在克隆后的一周至第10天，显微镜下可观察到U型孔底约有1/2~1/3被细胞布满，当孔中细胞数达150~500个细胞时，即可吸出上清液，用各种方法尽快检测相应的特异抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，一部分细胞用于扩大培养冻存，一部分细胞可继续按同样的方法再克隆。

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发表于 2012-3-15 13:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为确定所得的杂交瘤细胞为单个细胞克隆，可用下述Poisson公式加以验证：
f（0）=e-λ
f（0）为无细胞生长孔，λ为预定的每孔克隆数，e为自然对数的底，e=2.71828
设λ=1,则f（0）=0.3678
由此可知，要得到每孔只有一个克隆的概率，则有37%以上的孔应无细胞生长，如果连续两次克隆化都符合Poisson分布的单个克隆的生长孔数，而且全部克隆生长孔的上清均检测出阳性抗体，就可以认定已得到能分泌均一抗体的单克隆杂交瘤细胞系。

大家一块来努力吧,你们在实验过程中有那些不同以及有什么好的建议都来说说吧......

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小中大

自己再写个实验室的吧
骨瘤细胞的制备
1 眼眶放血处死小鼠,酒精消毒
2 背部剪开小鼠外皮,暴露骨瘤
3 小心取出瘤子,放入少许hanks液中,碾碎,转入15ml的离心管中,静止几分钟,吸取上清入50ml离心管中,1000rpm离心5min,去上清,加入少许培养基,取瘤细胞镜检.
4 分两瓶培养

抛砖引玉啊,都来谈谈你们如何操作的吧

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发表于 2012-3-15 13:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顶一个，支持一下！
问个问题，骨瘤细胞为什么还要制备？买来的细胞系不可以用吗？
我个人觉得单纯的细胞融合技术是很成熟的，而抗体制备却是运气占很大成分的。如果能把融合过程中，两个细胞的细胞器合二为一的机理明白，技术才会发展吧。

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小中大

关于骨瘤细胞的制备,当然现在基本都是买来的细胞系体外培养,但如果为防止骨瘤细胞反祖,除了用8-AG筛选外还可以注射入皮下长瘤在保存.

chuntian1983[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

偶以前也是做单抗的,感觉一个累啊.做了半天还没什么结果
感觉运气占一部分,不过个人觉得整个实验室的环境也很重要,有个有经验的师兄带着,大家相互帮忙,可能更容易出结果.

sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

弱弱的问一下，融合后的细胞全部换掉培养基之后要多长时间才能检测上清抗体浓度

moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-3-15 13:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主能告诉下常用的小鼠骨髓瘤细胞株的特点是在哪里查到的么？他们各自的应用是是什么？

moonlight45[使用道具]
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小中大

弱弱的问一下，融合后的细胞全部换掉培养基之后要多长时间才能检测上清抗体浓度

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不知道你融合后细胞全部换掉培养基是什么时候，如果是细胞可以进行检测的时候，想二次检测，那么一般在2-3天后；如果你融合的细胞生长的比较少的情况下，你全部换液了（这是不推荐的，融合细胞容易死亡），想进行检测，就得等细胞培养基颜色变黄。当然污染的除外。

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