细胞世界

论道稳定株筛选，这个里面学问很大，不是一言两语能说的清楚的，我大概筛过几十种细胞的稳定株，算是有些小经验，有空我可以开个专题，和大家分享一下，如何用不同的载体去筛选稳定株，不同的细胞又要注意什么，现在又有什么新技术可以做稳定株筛选，使用稳定株筛选做实验，要设计哪些对照。

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趁这个机会也向高手们请教一些这方面的问题。

我们在用真核表达载体如pcdna3.0或者pEGFP-c1等做稳定克隆时，常常发现，在药物筛选后期（1-2周）所形成一些耐药的克隆并没有目的基因的表达，而且这些克隆占大多数，为阳性的克隆筛选造成很大麻烦。有人认为是细胞在药物筛选过程中产生了耐药，也有人认为是质粒插入基因组非活动区导致目的基因不表达，但这些解释并不能很好解释假阳性克隆的问题。

那么，细胞筛选中这么高的假阳性问题到底是怎么回事？

所以，很期待高手们能集思广益，不吝赐教，一解小弟多年来心中疑惑，感激不尽！

1，您讲“环形质粒随机整合，可能导致抗性片段插入而目的基因未得到整合”，但是质粒5000bp左右的大小相对于真核基因组简直微不足道，我之前的看法一直是质粒片段作为一个整体插入基因组，若仅仅是抗性片段插入而目的基因未整合的原因，感觉这个几率几乎微乎其微。

2，您讲“当使用不正确的细胞密度和药物浓度进行筛选，最容易得到假阳性”，我可以理解为细胞密度大和药物浓度低容易得到假阳性吗？但是我一般做筛选的时候，药物浓度是实验前摸好的杀伤浓度，细胞密度基本是一个dish中10e5个细胞，基本已能分成单个。甚至有些细胞情况下，我在消化重铺细胞过程中就已加入药物。在这种情况下，没有转入质粒或者没有抗性基因表达的细胞基本可以看到大量死亡，但是最后所得到的一些有抗性克隆还是无目的基因表达。

3，我也觉得细胞自身产生耐药性几乎不可能。

4，恩，为了加快试验速度，我们的确是用克隆环挑选的克隆。96孔进行筛选周期太长，且与导入基因也性质有关，所以在实际操作中极少使用。

5，请问您有没有细胞筛选假阳性成因的文献？难道这么一个细胞操作中常见的现象，没有相关的系统研究，而仅仅是猜测和推断吗？

1，质粒是随机插入，不是同源重组，其整合区段和基因组大小没有关系，环形质粒随机整合，不仅是整合位点随机，质粒上的片段整合位点自然也是随机的
2，100mm dish 10^5细胞，密度到还可以，药物浓度要看你的细胞生长速度，大量死亡是哪天开始发生，几天能出现绝大部分死亡的情况？另外，你的基因，有细胞毒性吗？或抑制生长，或诱导凋亡及其它死亡？
3，96孔板筛选与导入基因性质有关，是什么意思？没看懂
4，这方面的文献没有关注过，在7，80年代应该有相关的文献报道。这个现象控制的好，并不常见：）最后，关于对假阳性的系统研究，你这个问题问的很好，有时间，做一些数据，可以发表成论文的。

我用过一些抗生素进行筛选，G418，Zeocin，blasticitin和puro，不同的抗生素，细胞开始大量死亡的时间有所不同，一般是puro最快（1-2天），G418和blasticitin次之，zeocin最慢（10天，用量大，贵）。
我做过的基因有抑制细胞生长的，也有促进生长的，但假阳性现象都存在。我周围的朋友以及丁香园上的一些战友也常常遇到这样的情况。细胞生长需要communication，分离到单个孔的单个细胞会停止生长，尤其在转入了抑制细胞生长的基因以后，从单个细胞获得克隆，我感觉几乎是不可能的。

另，我挑到的一些假阳性克隆，在随后的培养中仍然能保持药物压力下持续增长，因此我还是认为是质粒插入，但目的基因沉默或者部分插入。思路迪凋亡对invitrogen的解释有何看法？我主要是想看下原始文献，但不知道如何下手，请指教。

1，单细胞长成克隆，也就是用96孔极限稀释法，是最常用的方法，不用怀疑单细胞获得克隆的能力。抛开稳定株筛选不说，许多实验都依赖于单细胞长出克隆这个过程。即使是用克隆环挑选，最佳的情况，也是由单细胞长成的致密的单克隆，而不是那种松散的成团的多克隆。

2，invitrogen的说法是存在的，不过这样的情况在常规的肿瘤细胞中不常见，多见于ES筛选。

关于silence的文献是有不少的，但多数和常规的稳定株筛选无关，多和ES line有关。稳定株筛选，是否有相关的文献报道，我可以推荐我朋友来回答，他博士和博士后期间是专门研究cell line development的，比我更有经验。