[求助]人黑色素细胞原代培养

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标题:[求助]人黑色素细胞原代培养

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠,本人已经养了三个多月的细胞了,可是现在细胞还是未见增长,而且不知道原因在哪,特求高手帮忙分析原因.
来源:成人包皮
方法:先用dispase 酶消化过夜16个小时,分离表皮和真皮,然后将表皮用胰酶消化,含血清的培养基终止,200目过滤,离心,接种.
培养基:为Gibgo M-254专用培养基。
细胞生长很慢，不形成集落，零星散在，请问原因可能哪些？崩溃了

DDD[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

M254应该只是一个基础培养基吧？
你加入血清和TPA之类的促黑色素细胞生长因子了吗？

newway[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是基础培养基，购买时买一生长因子HMGS，配套的

血清没有说要加阿

bananapeople[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

黑色素细胞相对比较好养。看你的步骤大方向没问题。可能是某个细节没处理好。

langlang[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也养了半年多的黑素原代，方法基本与你相同。
细胞生长慢可能原因：
1、消化过度：相对于角质形成细胞，黑素很不耐消化，所以胰酶消化的时间不能太长，否则大部分黑素都死了或状态不佳。我的经验是在镜下观察，表皮碎片边缘有少量细胞出来就终止消化，时间大约5min（37°）。
2、细胞过稀或过密：细胞过稀，则贴壁的黑素少，黑素细胞相互间联系少，进入快速生长期慢。细胞过密，尤其是过筛网时研磨过分，很多纤维结缔组织混入细胞悬液，沉淀至瓶底，影响黑素贴壁。我一般一个成人包皮分两瓶60ML培养瓶。
3、培养基过期：254的保质期不长，且需要避光保存，若过期，则黑素生长缓慢。我们原来也发现原代3个月才长满一瓶，换了新培养基就好了。

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我试过直径3cm培养皿，六孔板都不太好，而培养瓶的细胞第二天都没有贴壁，而且我是新手，操作也不太熟练，所以一直不敢用培养瓶
消化时间我也是一般都5分钟，细胞密度我倒是一直凭感觉。。。培养基我也换新的了，而且看了说明书，添加了生长因子的M254只能保存一个月，所以新订之后分次添加培养基了

想请问下，这个过程的细节有哪些注意的？

vivian4123[使用道具]
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发表于 2012-3-15 17:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看看我的细胞吧,这是四倍的,一周的时间