小中大[讨论帖]神经细胞原代培养
神经细胞原代培养
从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备
1. 器械和器皿
器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等
各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60C烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1) 玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，
用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
2) 培养瓶、盖玻片
培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
3) 移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
4) 塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
4. 培养基和培养用液的配制
1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140，000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4C保存备用（分装前需56C灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4C过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成12ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。实际使用温度一般为37C 2030分钟。
6) 解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。
D1平衡盐水：NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO4.7H2O 0.045g、KH2PO4 0.03g、酚红0.0012g、三蒸水50ml。
蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。
HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl调pH至7.37.4，加三蒸水至28ml。
将D1、SG和H三者合在一起并稀释到1000ml即为解剖液，小瓶分装成5ml后置4C 备用。
二、培养细胞操作
1. 涂培养基
一般在细胞培养前12天，将使用的塑料培养皿（35mm）、24孔、96孔培养板或消毒的盖玻片涂上一层Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。
2. 实验动物准备
动物的年龄和取材部位对培养细胞的成活率关系密切，需根据具体实验而定。如大鼠海马细胞培养，以18天胚胎或新生48小时内的大鼠为宜，而培养背根神经节与脊髓神经元以1113天胚胎小鼠、大脑皮层以小鼠1621天、小脑细胞取自临产或新生动物。
3. 进入培养室操作
1) 穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。
2) 安放消毒的实验用具，如培养皿、解剖器械、玻璃吸管、培养板等于桌面适当的位置。
3) 将平衡盐水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同时准备一个冰袋和污物盘。
4) 解剖动物以新生大鼠取海马组织为例：将新生大鼠投入80％的酒精中，消毒510分钟。用解剖剪断头，并移入玻璃器皿中，沿中间骨缝将头骨剪开（头骨外侧下沿也剪开），然后剥开头骨暴露大脑半球，去脑膜，沿中线将大脑半球往外翻开，暴露内侧面半月状的海马组织。用弯头镊子轻轻夹起，放入解剖液内（培养皿可置于冰袋上）。待数个动物均解剖后，将培养皿内的海马组织移至解剖镜下，仔细去除血管、膜及非海马结构（取材干净非常重要）后，再移至小培养皿中，加数滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。
5) 在上述海马组织加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，摇匀后置于37C培养箱内消化2530分钟。
6) 将消化好的细胞碎片移入2ml的离心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培养液2ml终止胰酶作用，约10分钟后，再更换一次全培养液以洗净胰酶。（全培养液成份为80％DMEM、10％胎牛血清、10％马血清或小牛血清，胎牛血清有助于细胞贴壁）。
7) 用口径较小的、在火焰上光滑过的玻璃吸管吸取细胞团，移入另一离心管，加入2ml培养液并吹打20次。将离心管斜放，让细胞碎片下沉510分钟后，吸取上层细胞溶液约1ml。离心管中再加入培养液1ml，同上吹打并吸取细胞，与第1次吸取的细胞混合一起后计数。
8) 按所需的细胞浓度接种在事先准备的塑料培养皿、细胞培养板中，用盖玻片则需滴满。接种后移入37C的5％CO2培养箱，培养1天后可用无血清培养液，1星期换液2次。
三、细胞识别
根据细胞外形及内部结构进行细胞的识别。神经细胞具有显著的特征，培养中的贴壁的神经元突起很明显，特别是树突由粗而细，有分支，突起的末端有膨大的生长锥结构，正在不断变化；细胞体呈圆形、梭形、三角形或多角形不等，胞体较厚，具有空泡状核，有明显的核仁；立体感强，常见“晕”。
培养细胞中可包括几种神经元的类型和非神经元的“背景细胞”，即成纤维细胞、室管膜细胞和几种胶质细胞。
成纤维细胞贴壁最快，呈扁平状，胞核卵园形，有并列的两粒小核仁，从胞体两端发出细长突起。胶质细胞贴附在胶原上和成纤维细胞形成一层“地毯”。神经细胞贴壁较慢，落在“地毯”上生长迁移和分化。
培养的神经细胞可按一般Nissl法染色或免疫细胞化学特异性染色加以鉴别。
