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标题:[讨论贴]谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒?

吴才子[使用道具]
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[讨论贴]谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒?



有谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒,想讨论一下。


[ 本帖最后由 吴才子 于 2012-3-18 08:42 编辑 ]
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园丁##[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 吴才子 于 2012-3-18 08:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


有谁用过Amaxa公司的Lonza电转染试剂盒,想讨论一下。

你要讨论什么方面?这个东西,我用得比较多,算是它的第一批客户吧,非常好的东西。
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吴才子[使用道具]
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回复 #2 园丁## 的帖子

你好,谢谢关注。
我用它来转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞,转染前收集1*10^6个细胞,电转之后到6孔板,10小时后用碧云天的蛋白提取试剂盒提蛋白,但是在镜检的时候,发现细胞可能只剩下1/2不到了。。。死亡过半
最后提完蛋白,测了一下浓度,只有20~30ng/ml的浓度,我感觉做WB,这个浓度肯定不行。
怎么解决死亡太多细胞的问题?有没有好的建议?
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园丁##[使用道具]
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几个问题:
1,你是用的它推荐的程序和溶液吗?所有操作都严格按照它说的那样做了吗?
2,你用这个成功转过其它细胞没有?我想知道你操作上是否正确。
3,你的细胞状态如何?平时培养,传代是否正常。许多细胞转然后死亡率高,和细胞本身代数过老,状态不佳有很大关系。
4,你观察过24h,48h后细胞存活状况么?电转之后,我建议你至少做一次预试验,观察一下细胞恢复的时间,有些细胞本身贴壁就比较慢,电转之后,受点损伤,需要恢复的时间长点很正常。
5,你的plasmid我假设质量是合格的。
6,以上这些都正确操作,而且48hr后死亡还过半的话,我教你一个小trick,用a23程序,solution v,做一个质粒量的转染梯度,还是那么多细胞,2,4,7,10ug转染,取一个存活,效率综合都比较好的。
如果a23程序你的细胞还大量死亡,可以肯定你的细胞状态不好,和转染无关。因为这个程序作用极弱,正常的MDA-MB-231细胞是比较贱养的细胞,不会受到伤害的。
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woshituzhu[使用道具]
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1.我肯定是按照试剂说明书上推荐的程序操作的,严格操作。
2.我们这其他实验室也做过,一样的试剂,一样的细胞,比我的效果要好。
3.细胞状态的话,不敢保证非常好,因为我也不知道MDA-MB-231这个细胞在非常好的状态下是什么样子的。但是我感觉,MDA-MB-231这个细胞,为什么总是在显微镜下能看到在细胞上面有许多黑点儿?? 是我的细胞有问题,还是这个细胞天生就有黑点儿?
4.我没有观察过24h,48h后细胞的状态。因为我根据试剂盒说明书上推荐,4~8h后就可以检测,但是,我征求了其他人的意见,知道可以等细胞长到48h后再收集,这样细胞数量会多一些,而且,保证转进去的基因正常表达。
5.质粒用天跟的无内毒素质粒大提试剂盒,大约在6个月前提的,一直保存于-20冰箱中,冻容少于5次。
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园丁##[使用道具]
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我估计细胞状态是很大的因素,你这细胞可能代数太老或者污染了支原体,这是常常导致转染死亡率高和效率不高的重要因素。
你先用a23程序操作一次,48hr后观察贴壁和转染状况。
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吴才子[使用道具]
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可能吧,我也不确定。不过血清都是用四季青的无支原体血清。我也不知道支原体污染是什么样的,但是,不是整个培养瓶都有黑点,只是细胞膜表面有黑色的点,像麻子一样。
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园丁##[使用道具]
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同学,四季青的血清。。。。。。我建议你更换血清培养,极有可能是支原体污染导致细胞转染容易死,支原体污染对转染的影响是臭名昭著的,从转染效率,转染效率稳定性,到细胞存活,全面影响的。
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jujuba[使用道具]
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你好,我也要买该试剂盒,我想问一下你们查找到了该产品的MSDS(MATERIAL SAFETY DATA SHEET )了吗?可以告知我吗、?非常感谢!
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园丁##[使用道具]
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要MSDS干吗用?你只要product sheet,知道怎么操作不就可以了?
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