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标题:[求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因

薄荷侠[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]MTT实验未加DMSO前变黑色原因




请问各位大虾，本人近来做MTT实验，用药物干预后，加入MTT试剂（加之前镜下观察发现细胞状态可，无明显污染），继续培养4小时后，准备加DMSO时发现培基颜色变黑，倒置显微镜下发现黑色固定物质沉积，加入DMSO后沉渣大部分溶解，酶标仪比色发现吸光度值特别高，大多1~2以上，不同浓度间部分还是有差异，但与平时吸光度明显不同，请教了几个以前做过的前辈，说是可能被污染了，但加MTT前确实无明显污染，加的时候也是在无菌间操作，MTT也经滤器过滤的，今天换了人家做过的MTT试剂也还是变黑了，请大家帮我分析原因，谢谢！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应当是污染了，只有污染才会这样吧。污染你可能没看出来吧
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HP007[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有遇到这种情况，但同样的做法同学的药就没问题啊~是药物和MTT起反应了？
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发表于 2012-3-18 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该不会是药物的原因。因为连对照的未加药物的几个孔也变黑了，我后来怕是不是血清有影响，还特意在加MTT前把原来的培基换成无血清的培基，结果还是变黑了。但我确实没看到明显污染，细胞生长较快，无明显漂浮物质及颗粒沉积，培基也无浑浊。请问鉴别那种不明显污染有什么好的办法？还有做MTT有什么需要注意防止污染的地方？谢谢！
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发表于 2012-3-18 11:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
换新的培养板，重新配制mtt溶液，再做一次试一下。
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
根据你的描述，可以排除药物和MTT反应的可能，我感觉还是污染了，根据我的经验，MTT中污染的几种表现如下：
1.加入MTT前细胞状态不好，肉眼看培养液混浊，镜下大量细胞破碎、溶解、视野模糊、悬浮物较多；
2.黑角虫大量繁殖（它的数量和细胞状态相反，细胞状态好时，基本看不到）。
3.加入MTT后很短的时间（1－2MIN）内就变黑，而且是黑的反常，颜色很深。
4.跟以往的实验数据比，OD值过高（1.5以上，当然你的细胞密度太大则另说）；或OD值的增大与药物浓度明显不符。
5.加入DMSO之前，移去上清时，结晶很容易脱落，或大量脱落。
当然你首先要保证好MTT是无菌的，呵呵，仅供参考！
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇见过这样的情况,我实在同步化24小时以后加药,分不同时间点,短时间点比如4小时,没有这样的情况,但12小时或24小时就出现变黑,有时是个别孔,有时是整个扳子,后来我缩短了同步化的时间,时间点也尽量缩短,就避免了这种现象.当时我的感觉是细胞长期处于无血清状态下已经死亡了.
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发表于 2012-3-18 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为是你的细胞数太多的缘故!!!有人支持吗??
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薄荷侠[使用道具]
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发表于 2012-3-18 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢各位回复，我今天又重复了实验，结果还是变黑了，加MTT后约5min就可以在镜下看到黑色的网格状的结晶样物质，而且加药组和对照组都有，但空白组没有，也就是加细胞的都有变化，参照另外未加MTT的板子，可以隐约看到背景有点模糊，是不是种板子时候已经污染了，但好象细胞长得还可以，密度也不大，MTT也过滤过的。请问各位是否隐性污染是不是对细胞生长影响不大？准备在严格无菌操作下再做一次。
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 小中大

污染了，我也遇到 过
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