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标题:[求助]神经元MTT，OD值过低

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-3-20 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]神经元MTT，OD值过低




我现在培养的是皮层神经元，肉眼观察神经元长势良好，第六天时突触已连接成网，但是测MTT却总是偏低，只有0.0几，连做好几次都是这样。虽说计算出来的细胞存活率趋势还算正常，也具重复性，但心里总有点打鼓，害怕误差太大。因为我做的是缺氧缺血模型，需要低灌注，所以只加了50微升液体，但是还是加了10微升MTT，是不是MTT浓度太高了啊？如何镜下观察确定神经元活力好坏?
我现在是欲哭无泪啊，养一次神经元需要一周，每周结果都不理想，时间过得太快了~~~~~大家帮我分析一下啊~~~

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发表于 2012-3-20 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我遇到类似的问题，加入MTT后细胞根本不形成结晶，与无细胞孔OD值没有区别。我都怀疑这种方法了.....
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发表于 2012-3-20 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

OD值小于0.2的区间是非线性的，误差肯定大，发国外文章是不行的。
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发表于 2012-3-20 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MTT是跟细胞数成正比的，你的细胞数会不会太少了？MTT本身就是杀死细胞的，太浓了可能会不好吧，通常我们加的都是0.5mg/ml，但这已经是挺高的浓度了，所以还是不要再加了吧。
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发表于 2012-3-20 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了，你的MTT不会是放太久了吧！最好现用现配才好。
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发表于 2012-3-20 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的MTT是现配的，能形成一些结晶，就是比较少，与无细胞组也有区别，就是值较低。我的细胞数挺多的，大约50000个每孔。今天准备用低一些的浓度试一下。
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发表于 2012-3-20 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我又大概想了一下，还有以下几种可能是：
1 造模太严重了，把细胞全都杀死了，你可以跟空白孔比一下数值。
2 MTT是不是有问题，看浓度是不是配错了，你加的10ul是工作液还是10倍量的储备液？
3 你用的DMSO是不是有问题，确定没问题后是不是加的量不合适，你可以用几个孔试一下，量不一样OD值也不一样。
4 最后还提醒几点也许不是问题的问题啊，培养液中无酚红吧？检测波长多少？加 DMSO后振荡时间多少。
能想到的就这些了，Good luck!
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发表于 2012-3-20 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.我配的MTT浓度是5mg/ml，加了10ul,我加MTT前用PBS洗了三遍细胞，最后加了50ulPBS,再加的10ulMTT。
2.我说的OD是正常对照的,就只有0.0几。造模后最低为0.00几
3.DMSO是新买的，我加了50ul，振荡10分钟。
4.检测波长570nm
培养液中有酚红会有影响吗？
我这样做有问题吗？
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idea2011[使用道具]
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发表于 2012-3-20 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我同学也是做皮质神经元的阿，没见有什么问题啊！你考虑过是模型过于严重吗，你的四周不加细胞的孔OD值是多少啊，还有你试着按照书上的剂量、要求做一遍试试，正常的应该加100ulPBS，100ulDMSO，你再试试看吧！我们都是弃掉培养液后直接加入100ul 0.5mg/ml的MTT，你也可以这样做一遍
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jrwyyplt[使用道具]
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 小中大

战友们，我用同一批细胞同一个板作了一个试验，一半直接向培养基中加入MTT，不换液；另一半用PBS洗三遍，加入100微升PBS（量同培养基）后再加MTT（量同前)。结果相差好大啊，现在还没上酶标仪分析，但肉眼明显看到不换液那一半紫色结晶形成很多，颜色明显较深，而用PBS洗后，几乎没形成紫色结晶，颜色几乎是无色。我都快哭死了，是什么原因阿，镜下看洗后细胞形态没有改变，也没有看到有细胞被冲走，难道是神经元太脆弱，这样就死了？我配PBS时忘了调PH值,后来测了一下是7.0左右，这样有影响吗？大家帮帮我啊~~~~~
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