小中大[求助]ROS检测
最近在做一种药物对PC12细胞H2O2氧化损伤的保护作用。用碧云天购买的ROS检测试剂盒检测细胞内的ROS含量。
实验过程：将PC12细胞接种于六孔板内，待细胞长满后，1. 装载探针
PC12属于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，我加入1ml,37℃细胞培养箱内孵育30分钟。中间每隔5分钟摇晃一次，以使探针充分接触细胞。然后用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2. 实验
我做了5个孔，第一个孔为正常组，第二个为只加终浓度为200uM的H2O2，后面三个先加不同浓度的药物（分别为10ug/ml，60ug/ml，120ug/ml）
第一步，后面三个孔加入不同浓度的药物，前两个孔以无血清的1640代替，孵育30分钟
第二步，后面四个孔加H2O2，第一个孔加无血清的1640代替，孵育1个小时
第三步，荧光显微镜下观察
发现细胞有死亡，但就是没发现有荧光，应该是探针没装上，但我又实在想不出为什么没装上？
本科毕业论文急着用，还请各位高手指点，先谢谢了！
