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标题: [求助]关于脐静脉内皮细胞的原代培养 [打印本页]

作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:49 标题: [求助]关于脐静脉内皮细胞的原代培养

各位战友，我最近开始养脐静脉内皮细胞，事事不顺，但不知道问题出在哪里，还请大家支招帮忙！现把我原代培养过程给大家说明一下，附图，如下

作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:55

血管充盈的样子，里面是胶原酶

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:56

温箱中消化10-15min，取消化液，感觉难抽极了！

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:56

可能是因为用手挤了一下脐带，有很多类似结缔组织样的东西也和细胞混在一起了

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:56

把倍数放大一下再看看，4h后的

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:57

14h后的，换液了，这算是培养瓶中细胞最多的地方，其它地方稀疏得很.....

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:57

14h后的，换液了，这算是培养瓶中细胞最多的地方，其它地方稀疏得很...... (上面那张是细胞少的图)

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:58

这是28h的，从这时候我开始分不清什么是细胞，什么事杂质或碎片......

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作者: fsdd817 时间: 2012-3-21 15:58

38h的，从这时候我以为这些亮晶晶的东东是细胞，可是放大倍数，并把视野暗下来，才发现这些东西暗暗的，不规则，以前的那些圆圆的细胞也不见了，这些亮东西还是贴壁的......

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作者: dragonkilly 时间: 2012-3-21 15:58

1. 取消化液直接松开止血钳就可以了，还要多次冲洗血管内壁呢；
2. 你的消化完全没效果，你获得的细胞可能只是一些血细胞而已；
3. 最重要的地方：你的培养液是错误的，这个培养液不可能培养成功。

作者: 101010 时间: 2012-3-21 15:59

我们做的是股动脉内皮细胞原代分离，大体过程相似。说一下自己的意见，仅供参考。
1. 血管长度问题：由于动脉有分支，我们大多时候用1－2cm的动脉分离，分离出的细胞量有个体差异，但够用。你的脐带血管太长，消化不够充分，冲洗也相对困难。建议分成几段消化。
2. 消化过程：我们用胶原酶，37度，15－20分钟，期间抽推3次，保证消化充分。鉴于你血管两端均夹死，可以忽略此过程，但要保证酶消化充分。
3. massage 血管：由于我们用t型通透管，一段联接针管，先将酶抽回针管，用无菌镊子分三个角度轻轻磨差血管，每个角度磨差完，将酶来回推抽两次，目的是为了让内皮细胞脱落。这个步骤比较关键，力道要适度。
4. 冲洗：用45ml冲洗液经通透口用力冲洗血管。此步骤也比较关键。3和4步骤保证收集到内皮细胞。
接下来就无关紧要了，不外乎离心，培养，换液。

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 15:59

谢谢两位的支持！
我想问问：那该用什么样的培养基呢？文献上都在用M199，我买的是粉剂，本身就有谷氨酰胺等，我只是加了碳酸氢钠和血清及双抗，对了，碳酸氢钠我用的也是粉剂，过滤的，每一升培养基应该加多少碳酸氢钠才能让PH在7.2-7.4呢？
还有,我正在考虑要买个T型或者是三通管，用注射器真的不方便！
现在想想。里面真的可能混有大量的血细胞，应该是消化之前缺乏冲洗的缘故......

作者: 101010 时间: 2012-3-21 16:00

忘了说一步，将血管一端系在t型通透管上，接着用flushing medium 冲洗一下，去红细胞，然后用少量胶原酶冲一下，再用无菌外科线系住另一端，将胶原酶从t型通透管处注入，充盈血管，然后是消化过程。
脐静脉比股动脉的管腔大很多，一定要找到合适型号的T型通透管，保证能紧接扎在通透管端，不活动，不漏液体，才能保证血管充盈度，和消化质量。

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:00

今天又做了一次原代培养，颗粒无收！胶原酶还是原来的胶原酶；只不过之前找错了血管，找成动脉了，今天看看血管的横切面，不就是最粗的这根是静脉吗？然后像往常一样，注入10ml左右胶原酶。
因为自己做试验比较慢腾腾，所以今天把消化时间缩到10min，基本上前前后后消化了13min左右，（以前消化13min离心后可是米粒大小那么多沉淀啊），然后收集消化液，又冲洗了一遍，收集冲洗液，谁知1000转10min后，离心管里什么都没有！！！
我就纳闷了，问题出在哪里？！
自我反省：1.我的胶原酶出问题了？一直把配好的胶原酶4℃保存
2.消化时间短？（就差几分钟这细胞就一个都没有）
各位师兄师姐，赶紧帮帮忙，年前什么都做不出来的话，过年过的不踏实啊！！！

作者: 101010 时间: 2012-3-21 16:01

我们的胶原酶保存在－20度，做试验时先将胶原酶放室温融化，然后在使用前放入37度水浴箱3－4分钟，然后注入血管腔，消化15－20分钟，加上随后的研磨和冲洗，一般能收到内皮细胞。我已经说了我们原代分离试验所有的要点，若还是不行，我就无能为力了。

作者: cocacola 时间: 2012-3-21 16:01

1. 2型胶原酶配置后，分装冻存，用前化开，37度预热；
2. 脐带不能有夹伤，管腔消化前一定要PBS或D-hank’s冲洗干净；
3. 三通管便于充盈和抽吸（手术线一端结扎、一端固定），消化中可轻揉或翻动脐带，促进消化，消化时间一般不超过12min；
4. 培养基可以用高糖DMEM或MCDB131，用进口胎牛血清（hyclone或BIBCO），可以不加细胞因子；
5. 接种后24h内尽量不要去移动培养器皿，利于贴壁。明胶对HUVEC贴壁效果一般，但有助于传代时缩短消化时间。

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:01

......听大家这么一讲，莫非是我的胶原酶不行了？
Oh my......胶原酶出奇的贵！太烧钱了！
听说细胞因子可以明显增强细胞的生长活力，不加的话传代只能3-4代，加了的话7-8代都行
我买不到三通管，郁闷

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:02

刚又做了一次原代培养，已经三天了，换液了，镜下看着细胞挺多的，就是不确定是什么细胞......总觉得背景上有很多黑点点，用酒精棉球擦了又擦，可还是有，莫非是污染？（不会是传说中的黑胶虫吧？）附几张图片，大家帮我看看吧~

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作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:02

这张也是低倍镜下的，从这张里面估计大家就可以看出细胞旁边那些黑黑的点点，会动哦

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作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:02

这张是400倍的镜下，正好没看到细胞，但却更清晰的显示了黑点点的模样，在高倍镜下才发现原来这每个黑点点周围都有一层像膜一样的东西，这到底是什么啊？！真的是污染了吗？怎么污染的啊？
为了排除培养基污染的可能性，我专门在镜下看了看用的培养基，亮亮的额，什么都看不到......
大家来帮忙喽！
在镜下各位觉得这是内皮细胞吗？

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作者: remenb 时间: 2012-3-21 16:03

是不是血细胞啊？

作者: remenb 时间: 2012-3-21 16:03

请问一下你的细胞大概几小时能贴壁呢，我也在养huvec，消化出来的时候还挺多的，第二天（18小时左右）也看到大半的贴壁细胞，谁知道换液后细胞就少了很多，好像贴的不牢，你有这种情况吗？我看你上面那张图是三天以后的细胞形态，蝌蚪状应该是对的，可我的细胞现在是第二天，没有那种形态，是圆形的，是不是要等三天后才可以看出形态呢？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:03

我的基本第二天就有很好的贴壁形态，多角形

作者: yapuyapu 时间: 2012-3-21 16:04

我的怎么一直都没有贴壁的形态呢，请大家帮忙分析一下原因哦，我用的是1640的培养基，是不是培养基不行啊？

作者: 00无名指00 时间: 2012-3-21 16:04

1640可能不行，换DMEM+20%FBS试试！

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:04

为什么1640不行啊，我看有很多文献也是用的1640,我用的是0.25%胰酶消化10分钟左右.

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:04

好像没有文献说是单用胰酶的吧？就算是为了省钱，也基本是胰酶和胶原酶1:1的比例啊

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:05

我看得文献上有单用胰酶消化的，难道是这方面的问题吗？你只用的胶原酶吗，自己配的还是买的别人配好的呀，文献上说单用胰酶可以消化8-12分钟左右。你现在养的怎么样了，我今天看了一下我的基本没有内皮细胞，我觉得都像是细胞碎片，你的那些会动的黑点点是什么东西啊。

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:05

你的双抗是怎么配的，胶原酶是哪种呀，谢谢哦！我现在养的很郁闷，基本没有收获。

作者: 04906 时间: 2012-3-21 16:05

看着不太像黑胶虫，应该是一些细胞的碎片吧！我也在做HUVEC的原代分离，现在做的情况是，细胞的贴壁状况不好，不知道这个明胶是不是好用啊？

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:06

又遇到了一个群友啊，我的基本上，没有看到内皮细胞的样子，现在看基本都是碎片，我也没用明胶包被，其实不用也行，你用的什么消化的

作者: 49888 时间: 2012-3-21 16:06

养内皮养得超级郁闷，现在打算买细胞株了

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:07

我用的是I型胶原酶，0.1％的，消化15min,原代不铺板也长得很好，传代的时候最好铺一下，我觉得铺板以后明显贴壁的要多些；
双抗配什么配啊，买成品的就好啊
做原代要多摸索才行，我就是做到第五次才做成原代，第六次才传代也成功的，加油啊，群友们！

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:07

做原代用哪一型比较好啊，我现在打算换成胶原酶或者混合

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:07

我现在养的很顺利啊，就用I型胶原酶就行，0.1％的浓度，37℃消化15min！
我也不知道那些会动的小点点是什么，不过只出现一次，现在就没有了
我做原代的时候不需要明胶铺板也长得不错，但是传代的时候最好用明胶铺一下，我对比过，铺了还是好一些，当然要注意无菌操作了

作者: flower-201 时间: 2012-3-21 16:08

我每次分离细胞总会掺杂很多红细胞，感觉在冲洗的时候明明是冲洗干净的。如果掺杂大量的红细胞会不会导致内皮贴壁不好呢？而且我初次换液都是24h后，不知会不会也有影响呢？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:08

我觉得你的换液有问题，我看的文献基本都是24h以内，我每次都是在12h以内，因为内皮细胞据说是4h贴壁，实际上2h就有贴上的了，只是形态上还没那么伸展，你换液太晚有可能导致其他优势细胞的生长
另外取材的时候就应该注意轻轻挤压掉血管里的血，消化前要冲洗3次，再往里注胶原酶
希望对你有帮助

作者: flower-201 时间: 2012-3-21 16:08

恩，谢谢，我试试12h内换液效果怎么样，我都会冲洗很多遍，但是每次仍然会掺杂红细胞，应该是冲洗不够吧，之前还想看看有没有添加红细胞裂解液之类的去除红细胞，但是看文献也都没这样的说法，所以还是乖乖的冲洗好了

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:09

放心，好好冲洗一下还是管用的，另外我自己总结：在消化过程中轻柔的挤压一下脐带是非常必要的！这样的话细胞多成团的脱落下来，你们试试吧，相信会成功的！

作者: shenkunjie 时间: 2012-3-21 16:09

我发现第一天基本可以贴壁但是不牢，而且换液后会少很多。所以现在我提了之后在也不理它了三天以后再看。

作者: shenkunjie 时间: 2012-3-21 16:09

请问楼上加了细胞因子了吗？我没有加，但用明胶包了瓶的

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:10

其实，我有一次用不加生长因子的培养液也培养成功了啊，只是长不了那么快而已。原代培养不用明胶包被也可以的，传代的时候铺板还是必要的

作者: xue258 时间: 2012-3-21 16:10

请问，你传代的时候是用0.25%的胰酶么？大概消化时间是多少啊？我前天重新分离了一次，现在48小时，已经铺满80%，感觉跟长疯了一样啊，得赶紧传代才行……但是之前传代的时候消化了两分钟结果细胞全部状态极差，没几天就全死完了，总觉得是笑话时间长了，是这样的么？

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作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:10

你用的是什么培养基？
我也是0,25％的胰酶，一般一分钟到一分半吧，两分钟会不会太久？据说内皮细胞还是对胰酶很敏感的，尽量不要太久 0票
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作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:11

M199，加了20%FBS，还有VEGF
之前就是传代出现问题，所以这个步骤就感觉很紧张，我看有文献说用直接滴血清的方法终止消化，你是用10%培基终止还是什么呢？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:11

你买了VEGF？多少钱，哪个公司的啊？
如果是明胶铺板，又是传代的话，细胞很难被消化下来，我也是用含有血清的培养基来终止消化的
我用的培养基是ECM，比较贵

作者: yhz1973 时间: 2012-3-21 16:12

我没有加细胞因子，因为和我的后续实验相关，今天换了胶原酶感觉细胞贴壁好了很多，而且第二天就有点形态了。可能0.25%的胰酶损伤比较大。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:12

0.1%的胶原酶？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:12

就是说嘛，应该用胶原酶的，恭喜你哦！我做原代刚成功的时候也是欣喜万分！
I型胶原酶，0.1％的就可以

作者: 小糖块 时间: 2012-3-21 16:12

我也是用胶原酶做原代的，但是现在传代的问题让我很头痛，做不好就浪费细胞

作者: gemei0115 时间: 2012-3-21 16:13

我看到有人用的脐带保存液加肝素的，加多少合适啊，浓度是多少啊？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:13

现在多使用肝素钠，医用的，0.125g/L

作者: 2541 时间: 2012-3-21 16:14

脐带保存液你们都用什么呀，都用PBS吗？我用的生理盐水，一般从产科取出来就会开始试验，还用加肝素吗？你们培养液里加没加肝素，不加有影响吗？谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:15

我的都加了，没试过没加的，你的如果细胞状态好，那就不加嘛

作者: newway 时间: 2012-3-21 16:15

请问，你传代的时候是用0.25%的胰酶么？大概消化时间是多少啊？我前天重新分离了一次，现在48小时，已经铺满80%，感觉跟长疯了一样啊，得赶紧传代才行……但是之前传代的时候消化了两分钟结果细胞全部状态极差，没几天就全死完了，总觉得是笑话时间长了，是这样的么？

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请问你是怎么分内皮的呢？我是用0.25%胰酶消化7分钟，然后用完培冲洗终止消化，培养液是用EGM2。10%胎牛血清，加生长因子，但第二天只有小小的圆形细胞贴壁，而且基本不增殖，换次液细胞就少很多，内皮是不是基本没消下来啊？

作者: newway 时间: 2012-3-21 16:16

放心，好好冲洗一下还是管用的，另外我自己总结：在消化过程中轻柔的挤压一下脐带是非常必要的！这样的话细胞多成团的脱落下来，你们试试吧，相信会成功的！

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请问消化时要把它放到孵箱里吗？挤压是在胰酶充盈时挤压还是用培养液冲洗终止消化时挤压呢？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:16

不用胰酶啊，都是用胶原酶的，0.1％的，100ML差不多用4-5次。
挤压的时候动作要轻柔，我是消化15min,其间挤压2-3次，你试试吧，应该没问题！

作者: kswl870 时间: 2012-3-21 16:17

不用胰酶啊，都是用胶原酶的，0.1％的，100ML差不多用4-5次。
挤压的时候动作要轻柔，我是消化15min,其间挤压2-3次，你试试吧，应该没问题！

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请问胶原酶0.1％配置是不是将买来的100mg胶原酶加进100ml的PBS或者无血清培养基中啊？

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:17

是啊，最好在过滤一下保证无菌才好

作者: one 时间: 2012-3-21 16:17

太好了，找到群友了。
超级郁闷，做了3次没一次成功的。请问消化时间过长也会收不到细胞么？我分别用了0.25%的胰酶+EDTA，0.25%的胰酶+0.1%胶原酶37°，30min，消化液离心后（1000rpm，10min）离心管底部都见到不到细胞，真奇怪了。求助！

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:18

我看了这么多文献，最长消化时间也就是20min,你的消化时间也未免太长了吧？
此外，没有道理颗粒无收啊

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:18

我的细胞倒是养出来了,还没有鉴定就都死了,现在的这一个培养板里的,也不好,为什么这些细胞都集中在一块地方,我看着比较集中的地方都该传代了,而且漂浮着许多不贴壁的细胞,我都换了两次液还是没有洗干净,每次都用PBS洗了３遍，而且我觉得状态也不是很好．有没有好的办法解决这个问题呀！谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:20

是原代培养吗？我的细胞刚消化下来时是成团分布，可是没两天就全融合了啊

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:20

我的是原代培养，我的也是两天就长满了，现在传代也传不好，有时吹打不下来，有是消化过了，把细胞都吸走了，现在还有污染这一关。

作者: dragonkilly 时间: 2012-3-21 16:20

我的经验就是千万不能加胰酶，用胰酶消化原代的话是不行的，细胞基本上是活不久，而且状态也不行。消化下来的细胞都会死的。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:21

那用什么消化呀

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:21

我用的是胰酶啊，没什么问题，细胞状态很好的。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:23

我现在每次传代都传不好,经常是吹打不下来,请问，你在传代方面有没有好的经验可以传授一下哦,我现在经常是一传完代细胞就不行了.你的细胞能传几代啊,你在几代的时候做的实验啊,我的细胞还没做鉴定呢,请问在鉴定方面有没有好的经验,谢谢.

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:24

我传代的经验就是放入胰酶以后不要把胰酶吸出，让细胞飘起来，直接放入含有血清的培养基终止消化，吹打，吸出，离心，没问题的！

作者: 66小飞侠 时间: 2012-3-21 16:25

谢谢哦! 我现在也是基本上这么弄的,我觉得这个细胞贴壁还是挺牢的,每次消化完后,第二天看就会有很多漂着的细胞.现在做了两次免疫组化都没出结果,我用的抗体都是国产的,请问你做免疫组化有什么好的经验可以传授一下吗?

作者: 8princess8 时间: 2012-3-21 16:25

我的免疫组化鉴定是用的冰箱过夜的那种。

作者: vivian4123 时间: 2012-3-21 16:25

我们实验室一般是先消化静脉平滑肌细胞，然后再取材动脉内皮细胞。
1、消化是用的二型胶原酶，一般是在培养箱里消化20min，期间还要间断的用手按摩下，即轻轻揉搓，翻转。
2、细胞离心不能速度太大，1000-1200rpm 5-10min吧。
3、一般情况下我们为了提高细胞的获得，会提前使用明胶打下底，PBS清洗三次即可。（FN有时候会用）
4、细胞的消化我们使用的也是胰酶，不过我们使用的是0.125%的，0.25%的消化后细胞状态不好。
5、动脉内皮细胞使用的是抽管的组织块法，也会用明胶打底的，清洗后，可以用FBS三滴左右浸润下瓶底。而且，一般情况下换用的培养基是要加入内皮细胞生在因子的。

作者: 8964357 时间: 2012-3-21 16:26

有时候细胞养不好可能是外界条件问题，让别人换个环境帮你养几天，我也遇到过类似的情况。养的好怎么弄都没事，不好的时候不知道为何，很抓狂。。。。呵呵

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