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标题: [求助]如何分离外周血单个核细胞 [打印本页]

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:46 标题: [求助]如何分离外周血单个核细胞

我想分离PBMC来研究TH1，2细胞，有些问题请教
1、有同学说，不用分离，直接刺激，再使用流式细胞仪检查CD3,8和IL-4，IFN-gamma，我觉得有些不妥，不知是否可行？
2、现在使用有什么方法可以分离？使用淋巴分离液吗？
我是新手，请各位指教。谢谢

作者: 101010 时间: 2012-3-23 11:46

1、需要分离。
2、Ficoll密度梯度离心即可。

作者: mamamiya 时间: 2012-3-23 11:46

因为你染得都是胞内，所以最好还是分离，这样效果比较好。分离液一定要买好，这个区别还是比较大的

作者: milkdog 时间: 2012-3-23 11:48

我做从外周血中分离CD4+T细胞和CD8+T细胞，是买的磁珠分离试剂盒，超贵。但是这样分离的纯度高，后面的实验需要比较多这2种细胞。

作者: milkdog 时间: 2012-3-23 11:49

不清楚你的研究目的是什么

如果只是想单纯测一下外周血中Th1，Th2细胞的表达比例，就不用分离PBMC，直接用抗凝全血做就行。将全血和培养基1：1稀释后加入PMA，离子霉素和莫能霉素，培养箱中孵育4-6小时，然后再标记CD3、CD4和胞内因子。

如果你想把这2群细胞分选出来，体外继续培养研究他们的功能就要先用Ficoll分出PBMC，然后用磁珠或流式直接分选。

作者: pencil菲 时间: 2012-3-23 11:49

不清楚你的研究目的是什么

如果只是想单纯测一下外周血中Th1，Th2细胞的表达比例，就不用分离PBMC，直接用抗凝全血做就行。将全血和培养基1：1稀释后加入PMA，离子霉素和莫能霉素，培养箱中孵育4-6小时，然后再标记CD3、CD4和胞内因子。

如果你想把这2群细胞分选出来，体外继续培养研究他们的功能就要先用Ficoll分出PBMC，然后用磁珠或流式直接分选。

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没有你这种做法，全血就想测Th1或者Th2？这样的结果别人是不会承认的。

作者: lixi559 时间: 2012-3-23 11:49

用Ficoll分离PBMC纯度不是很高，但是便宜，用磁珠分离纯度就很高了，价格偏贵点

作者: pencil菲 时间: 2012-3-23 11:50

用Ficoll分离PBMC纯度不是很高，但是便宜，用磁珠分离纯度就很高了，价格偏贵点

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用Ficoll密度梯度离心法得到的就是PBMC，什么叫纯度不是很高？

用磁珠分离的话应该是进一步分离PBMC中的某一种细胞才用的，如需要进一步分离其中的T细胞或者B细胞等才用磁性分离。

作者: tieshazhang 时间: 2012-3-23 11:50

我做从外周血中分离CD4+T细胞和CD8+T细胞，是买的磁珠分离试剂盒，超贵。但是这样分离的纯度高，后面的实验需要比较多这2种细胞。

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就算是用磁珠分离也应该是先用ficoll 先分离了PBMC再用啊，难道直接把磁珠用在全血吗？这样不经MACS试剂的用量大增，还会有大量细胞，包括红细胞，通过分离柱，很容易就堵啊

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:51

我们想研究外周血中的TH1/2，CD4+CD25+Treg细胞的表达情况，明确外周血全身的获得性免疫的状态。
同样的指标在疾病局部组织中的表达情况，进一步研究全身和局部的T细胞之间的相关性。
我还有问题想问问：
1、Iuduced Treg的培养是否需要IL-10或TGF-beta? 比如 tr1 ，有些文章中好像就跟普通的TH细胞一样，刺激后一起检查他们。
2、目前，Tr1 的指标CD4（CD3、8代替）+,CD25+,IL-4- IL-10+,是否正确？
3、IL-4荧光是不是标PE会好些？
4、如果想检查TH17，应该如何选择抗体？IL-17？

作者: 2541 时间: 2012-3-23 11:51

我们想研究外周血中的TH1/2，CD4+CD25+Treg细胞的表达情况，明确外周血全身的获得性免疫的状态。
同样的指标在疾病局部粘膜组织中的表达情况，进一步研究全身和局部的T细胞之间的相关性。因为，我们很多本专业学者认为，我研究的疾病是一种LOCAL的免疫异常引起。
我还有问题想问问：
1、Iuduced Treg的培养是否需要IL-10或TGF-beta? 比如 tr1 ，有些文章中好像就跟普通的TH细胞一样，刺激后一起检查他们。
2、目前，Tr1 的指标CD4（CD3、8代替）+,CD25+,IL-4- IL-10+,是否正确？
3、IL-4荧光是不是标PE会好些？
4、如果想检查TH17，应该如何选择抗体？IL-17？

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首先同意上面说的，要先分离PBMC后用磁珠分选出所需要的细胞。

然后对于你的问题做一下回答：

1. 我做过Treg，但是没有进行培养，PMA和ionomycin刺激后检测，但是结果和没刺激的差不多，后来就直接测，没有刺激。

2. 对于Treg的表面标记日新月异，当初我用的是CD4+，CD25+，Foxp3+，后来有文献报道CD127之类的，这个还是得看发文章比较认可的是哪一种方法

3. 没有这个说法，只是PE，FITC，APC比较常用

4. 可以选择IL17，但是还要加上其他的表面标记，因为能分泌IL17的不止Th17

作者: pencil菲 时间: 2012-3-23 11:52

我们想研究外周血中的TH1/2，CD4+CD25+Treg细胞的表达情况，明确外周血全身的获得性免疫的状态。
同样的指标在疾病局部粘膜组织中的表达情况，进一步研究全身和局部的T细胞之间的相关性。因为，我们很多本专业学者认为，我研究的疾病是一种LOCAL的免疫异常引起。
我还有问题想问问：
1、Iuduced Treg的培养是否需要IL-10或TGF-beta? 比如 tr1 ，有些文章中好像就跟普通的TH细胞一样，刺激后一起检查他们。
2、目前，Tr1 的指标CD4（CD3、8代替）+,CD25+,IL-4- IL-10+,是否正确？
3、IL-4荧光是不是标PE会好些？
4、如果想检查TH17，应该如何选择抗体？IL-17？

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1、首先你要明确检测和诱导是两个完全不同的概念。如果你要检测外周血或者组织局部是否有Treg，不需要刺激，直接检测就可以。如果你想从初始T细胞诱导Treg，就需要加anti-CD3，anti-CD28和TGF-β。

2、再者你要明确不同的调节性T细胞的概念和分类，你想检测所有的调节性T细胞，还是nTreg、或者iTreg。你要根据你的实验目的确定下来，不要随便拿一个就算。一般检测外周血或者局部的调节性T细胞，多数是检测所有的调节性T细胞，最多分一下是nTreg还是iTreg。

3、你说的不错，一般情况下，检测细胞因子最好选择荧光较强的荧光素，PE和APC都是首选。

4、检测Th17，CD4和IL-17双阳性就可以了。

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:53

是检测CD4+CD25+FOXP3+ nTreg 细胞

作者: TAT 时间: 2012-3-23 11:53

我想分离PBMC来研究TH1，2细胞，有些问题请教
1、有同学说，不用分离，直接刺激，再使用流式细胞仪检查CD3,8和IL-4，IFN-gamma，我觉得有些不妥，不知是否可行？
2、现在使用有什么方法可以分离？使用淋巴分离液吗？
我是新手，请各位指教。谢谢

作者: ALALA 时间: 2012-3-23 11:54

是检测CD4+CD25+FOXP3+ nTreg 细胞

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那你就直接去血分离PBMC后检测，不需要刺激的

作者: pencil菲 时间: 2012-3-23 11:54

是检测CD4+CD25+FOXP3+ nTreg 细胞

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CD4+CD25+FOXP3+是调节性T细胞的标志，包括nTreg和iTreg。

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:54

CD4+CD25+FOXP3+是调节性T细胞的标志，包括nTreg和iTreg。

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没有生长因子诱导下应该是nTreg吧？常规的PMA等刺激也能诱导iTreg

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:55

那要看你样品的来源是什么。

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如果来源于正常个体，那可能就是nTreg；但是如果来源于疾病模型或者患者，就可能是nTreg+iTreg。

作者: leifengta 时间: 2012-3-23 11:55

就算是用磁珠分离也应该是先用ficoll 先分离了PBMC再用啊，难道直接把磁珠用在全血吗？这样不经MACS试剂的用量大增，还会有大量细胞，包括红细胞，通过分离柱，很容易就堵啊

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嗯，是的，但是不知道是用常规方法分离出淋巴细胞，还是要将T、B细胞分离之后，再用磁珠，就是不知道这样下来细胞的活性会怎么样？你以前做过这方面的实验没？到时候要请教你啊··

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:56

CD127或FOXP3，选哪个好? 前者可以不用破膜。CD4+CD25+CD127-标记Treg 是否成熟？

作者: kewanqi2011 时间: 2012-3-23 11:58

CD127或FOXP3，选哪个好? 前者可以不用破膜。CD4+CD25+CD127-标记Treg 是否成熟？

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个人认为foxp3更成熟

作者: 8princess8 时间: 2012-3-23 11:58

用CD127会省事很多，筛选也方便啊

作者: pencil菲 时间: 2012-3-23 11:59

Foxp3才是Treg的特异性标志，不是CD127。

作者: fsdd817 时间: 2012-3-23 12:00

但如果要回收的话，只能用CD4+CD25+CD127-

作者: 8964357 时间: 2012-3-23 12:01

应用淋巴细胞分离液分离！想提高分离的纯度就应用免疫磁珠分离，但免疫磁珠分也得先用淋巴细胞分离液分离后，再过免疫磁珠，但用免疫磁珠分离时需要的细胞数相当多，才能分出实验用的细胞。

作者: utt0989 时间: 2012-3-23 12:01

我们想研究外周血中的TH1/2，CD4+CD25+Treg细胞的表达情况，明确外周血全身的获得性免疫的状态。
同样的指标在疾病局部组织中的表达情况，进一步研究全身和局部的T细胞之间的相关性。
我还有问题想问问：
1、Iuduced Treg的培养是否需要IL-10或TGF-beta? 比如 tr1 ，有些文章中好像就跟普通的TH细胞一样，刺激后一起检查他们。
2、目前，Tr1 的指标CD4（CD3、8代替）+,CD25+,IL-4- IL-10+,是否正确？
3、IL-4荧光是不是标PE会好些？
4、如果想检查TH17，应该如何选择抗体？IL-17？

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回复：

①诱导Tr应该加TGF-β，它是从的CD4+单阳性胸腺细胞的初始T细胞诱导外周CD4+CD25+FOXP3+Tregs必需的。你可设两组，一组未加，另一组加TGF-β，刺激培养后分别测定CD4+CD25+Tregs的表达。实验前看文献一定要看外文影响因子高的，对实验设计有益。这点非常重要！

②你选的Tr1的这几个指标不特异，结果出来可能会对你的研究帮助不大，你可查Th1分泌IFN-γ，可能这个指标更好些。

③无论是PE，还是FITC，它们仅是不同荧光的染料，标记的好与不好与染料的质量有关，进口的世界品牌公司的染料好。

④Th17细胞的检测应先上网查Th17细胞的特异性标记物，你选的IL-17也行，因为IL-17是它分泌的。两者结合的做，获得的结果更有说服力。

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