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标题: [求助]细胞上的【月丘】和【月坑】或者【水泡】！ [打印本页]

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:06 标题: [求助]细胞上的【月丘】和【月坑】或者【水泡】！

近几个月养的软骨细胞出现了很严重的问题，细胞表面总出现一些小亮点，球体，对细胞生长有一定的抑制作用，而且增值比较快。

细胞上清清澈，无臭味，油红染色不着色。

用双抗、环丙沙星滴眼液、万古霉素、两性B 试治无效，细胞最终被拖死。

实验过程严格无菌，更换了培养基、血清，但复苏后的细胞仍旧如此。

前几个月复苏的细胞以及细胞系出现这东西，
昨天做的原代又出现这些小点儿了。

在某位博士的毕业论文中我也看到了满视野的类似点状污染，不知是否对实验无干扰？

请各位大牛们帮我看看这到底是什么，如何治疗啊、、、、、、、、

上图：

1。低倍镜下（100x），图中黑色的点状都是，看起来像是细胞上的月球坑

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作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:07

2.培养4天后的软骨细胞，细胞外环状聚集的亮点（100x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11297

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:07

3.偶尔也有大小不均一的“亮点”，折光率高的软骨细胞都是被他们“整死”的（100x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11298

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:07

4.看这个简单清晰的（200x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11299

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:08

5.这一张更清楚，很恐怖，“亮点”喜欢围绕细胞呈环状包围生长（200x）。

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作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:08

6. 7天后，惨不忍睹（200x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11301

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:08

7.高倍镜下（400x）

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作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:09

8.另一张（400x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11303

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:09

9.这一张种板3天的“小黑点”和“亮点”都是，因调焦而呈现不同颜色（100x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11304

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:09

10.昨天原代分离的软骨细胞，过夜消化后，今天重悬时也发现这些“亮点”贴附在细胞表面（400x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11305

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:09

11.也有一部分散在于液体中（400x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11306

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:10

12.整个培养皿中就这一个小范围内出现的密集，其他地方很难见到“亮点”，能否排除是消化的细胞碎屑（200x）？

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作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:10

13.原代后第二天，刚贴壁的细胞又见“花环”（400x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11308

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:10

15.再来一张，请牛牛们帮我鉴定一下（400x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11309

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:11

16.没有战友支持？我再贴一张（200x）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11310

作者: 园丁## 时间: 2012-3-23 14:11

我看这个是细胞的空泡化现象

作者: ending 时间: 2012-3-23 14:12

我看这个是细胞的空泡化现象

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还请详细赐教啊~

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:12

再来上图
17.原代后第三天（200x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11311

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:13

18.这次竟出现了“大泡”（200x）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11312

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:13

19.（200x）

图片附件: 75558289.snap.jpg (2012-3-23 14:13, 18.52 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11313

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:13

20.这是ATCC网站上人软骨细胞的照片，貌似也有“小黑点”和“小亮点”，调整焦距后应该都是高折光率的球体。。。。。

图片附件: 1924.jpg (2012-3-23 14:13, 147.97 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11314

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:14

21.ATCC官网上的另外一株人软骨细胞的照片，同样有类似的小点儿。。。

图片附件: 1925.jpg (2012-3-23 14:14, 125.99 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11315

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:14

22.镜下可见泡状突起附着，常见环状簇集（400x）。

ps：哪位战友知道400x的镜子怎么调才能照清楚啊？？？

图片附件: 69065464.snap.jpg (2012-3-23 14:14, 26.6 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11316

作者: guagua 时间: 2012-3-23 14:15

请问ATCC上是不是每种细胞都有图啊？为什么我买的细胞看不到图？

作者: yychen 时间: 2012-3-23 14:15

请问ATCC上是不是每种细胞都有图啊？为什么我买的细胞看不到图？

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有的没有图片的

作者: yychen 时间: 2012-3-23 14:17

楼主的图片的确拍的不太清晰。
建议拍70%以下汇合度的细胞。
不过已经能够明显的看到胞内的空泡，以前我的细胞污染支原体的时候也出现过这张情况，不过是在严重污染的时候才能在光镜下看见胞内的空泡。

作者: yychen 时间: 2012-3-23 14:17

12.整个培养皿中就这一个小范围内出现的密集，其他地方很难见到“亮点”，能否排除是消化的细胞碎屑（200x）？

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消化后的细胞碎屑在换液后会去除。

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:17

楼主的图片的确拍的不太清晰。
建议拍70%以下汇合度的细胞。
不过已经能够明显的看到胞内的空泡，以前我的细胞污染支原体的时候也出现过这张情况，不过是在严重污染的时候才能在光镜下看见胞内的空泡。

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感谢群友的指点，这些球体亮点在冲洗换液后仍然贴附，按您说的应该不是细胞碎屑。
您指的“空泡”是照片里的突起球体吗？这是一种细胞死亡方式还是其他？
您说的支原体污染如何解决呢？
谢谢！

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:18

请问ATCC上是不是每种细胞都有图啊？为什么我买的细胞看不到图？

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有的细胞介绍上页面中带有一个小图框，里面画的一个显微镜，点这个就能看到图片了。

作者: redbutterfly 时间: 2012-3-23 14:18

我们的HUVEC细胞也这样，到底是怎么回事啊，急啊，到现在还没有养好细胞，高手赐教啊。在别人那里养的好好的，回来两代后就变成这样了

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:19

我们的HUVEC细胞也这样，到底是怎么回事啊，急啊，到现在还没有养好细胞，高手赐教啊。在别人那里养的好好的，回来两代后就变成这样了

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请问你用的是什么培养基和血清？
能否把你的细胞拍照上传看看？

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:19

23.再上图，最近突现不均一大小的“亮点”了，按照楼上几位战友的提示改称“亮泡”，最近一个月原代培养才出现的大型【亮泡】，图为原代第三天。（x200）

图片附件: 31580998.snap.jpg (2012-3-23 14:19, 29.63 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11317

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:19

24.再上一张原代第7天照片（x200）。

图片附件: 58353532.snap.jpg (2012-3-23 14:19, 48.16 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11318

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:20

25.还是第七天，环状分布，个别处见【大泡】（x200）。

图片附件: 83361998.snap.jpg (2012-3-23 14:20, 48.08 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11319

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:20

26.第十天时（x200）。

图片附件: 33466558.snap.jpg (2012-3-23 14:20, 54.28 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11320

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:20

27.第十天时，有这么一张图，不知道有没有什么线索。（200x）

图片附件: 61528333.snap.jpg (2012-3-23 14:20, 53.25 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11321

作者: tudou85 时间: 2012-3-23 14:21

28.一张400x的照片。

图片附件: 56569910.snap.jpg (2012-3-23 14:21, 33.8 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11322

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:22

28.一张【大泡】的特写（400x）。

图片附件: 56942209.snap.jpg (2012-3-23 14:22, 33.8 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11323

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:22

29.400x下一个细胞的花环。

图片附件: 73550617.snap.jpg (2012-3-23 14:22, 31.16 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11324

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:23

30.消化后的典型【泡泡】（400x）。

图片附件: 12340594.snap.jpg (2012-3-23 14:23, 37.82 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11325

作者: tieshazhang 时间: 2012-3-23 14:23

第六张图，好像是真菌污染啊

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:24

高折光度的不规则片段应该是死细胞，漂浮或一半漂浮一半连在壁上。
用两性霉素B试过无效。

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:24

发现总是表层细胞出现泡泡。。。

作者: dragonkilly 时间: 2012-3-23 14:25

我的细胞也和你的一样，抗支原体药、双抗以及两性霉素B均无效，郁闷中。Singer战友你是在上海吗？

作者: HPLC使者 时间: 2012-3-23 14:25

同样关注中啊，我们的细胞有时也有颗粒，单没真么严重啊

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:26

我的细胞也和你的一样，抗支原体药、双抗以及两性霉素B均无效，郁闷中。Singer战友你是在上海吗？

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我在天津。一度以为跟气候有关，看来可能没太大关系了。
PS：sorry，我是tudou，因为论坛限制发帖数量，所以我又注册了个账户，嘿嘿

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:26

同样关注中啊，我们的细胞有时也有颗粒，单没真么严重啊

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我半年前也没发现细胞这样，比这更密集培养时也没出现“水泡”。
用的血清变了，以前用的GIBCO的16000-044FBS就没事，后来再买的同一货号的GIBCO血清换成了“歪脖子”瓶包装，状况就出现了。
不知道群友们有没有什么线索？

作者: rxcc33 时间: 2012-3-23 14:27

从第七张图看，应该是霉菌污染啊，亮点的话应该是单细胞吧

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:27

从第七张图看，应该是霉菌污染啊，亮点的话应该是单细胞吧

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你是说编号7的那张400x的？第六张倒更像霉菌一些，但是基本上排除可能了。

作者: 101010 时间: 2012-3-23 14:28

取点细胞培养基，放在细菌和霉菌的培养基中，培养，看有没有什么生物长出来，用以排除这些污染？支原体的话，还是用来PCR的方法来确定？
另外，你的血清是不是质量不好啊，我们这边有一次，冰箱坏了，血清反复冻融了好几次，养出来的细胞，长满了像芝麻一样的麻点

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:28

多谢群友的指点，我曾尝试将10%FBS全培基孵育12天也没有在镜下发现异物。血清是Gibco 16000-044的，平时都是-20度保存，现用现融。不知道是不是血清的问题。
细菌和霉菌的培养基倒没有试过，支原体PCR检测也没做过，但用抗支原体的药似乎没效。

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取点细胞培养基，放在细菌和霉菌的培养基中，培养，看有没有什么生物长出来，用以排除这些污染？支原体的话，还是用来PCR的方法来确定？
另外，你的血清是不是质量不好啊，我们这边有一次，冰箱坏了，血清反复冻融了好几次，养出来的细胞，长满了像芝麻一样的麻点

作者: 969 时间: 2012-3-23 14:28

准备开始养软骨细胞，关注中

作者: yueban-1147 时间: 2012-3-23 14:29

请问你的人软骨细胞的组织来源是什么?我现在缺乏组织来源啊.另外你有什么促进贴壁的方法吗?

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:29

我用的是小鼠乳鼠做的原代培养，也做过初生小牛的膝关节软骨原代。
如果我做人软骨原代，应该是去相关医院和科室取关节置换手术的副产品吧。
贴壁情况好坏与很多因素有关。绝大部分细胞贴壁都很好的，状态不好的细胞贴壁慢，天气不好时细胞也会不好贴壁一点。
只要是按照正常的全培基配方养细胞就应该没有贴壁问题。

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请问你的人软骨细胞的组织来源是什么?我现在缺乏组织来源啊.另外你有什么促进贴壁的方法吗?

作者: 49888 时间: 2012-3-23 14:29

汇报一下：

更换了血清以后，所有“【月丘】和【月坑】或者【水泡】”症状消失。

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