标题:
[求助]细胞复苏,37°C水浴时间?
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作者:
bgf5
时间:
2012-4-3 17:11
标题:
[求助]细胞复苏,37°C水浴时间?
养细胞的时间有限,最近复苏的细胞都不活,对自己的技术突然间不自信了。
很初级的问题[sub]:朋友们水浴的时间都是多少秒啊?是将冻存管里的冻存液都化掉呢还是化了一半就可以了呢?
每次都是硬性的时间还是边观察边看看再决定复苏的时间?同学们稍有有时间都来说说,虽然是很初级的问题,大家做个经验参考。
作者:
bgf5
时间:
2012-4-3 17:11
自己顶下。请大家帮忙说说。谢谢。
还有冻存的时候不同的文献上就有不同的冻法,有些矛盾了。
作者:
66小飞侠
时间:
2012-4-3 17:12
我也是新手,前几天复苏了一次,时间大约1分多钟吧,边水浴边摇晃冻存管,实时观察解冻程度,感觉就剩一点冰(一厘米长左右的冰凌)的时候马上拿出来,迅速擦干水,喷酒精,拿进超净台,酒精棉球擦瓶口,一定要快。(复苏之前要准备好离心管,里面加入培养基,还要准备好1000ul的枪)用枪把细胞液转移到装有培养基的离心管中,5分钟600转离心去除DMSO~
也有说不用离心第二天再换液去除DMSO的,希望对楼主有一小小帮助~
作者:
8princess8
时间:
2012-4-3 17:14
当然是时间越短越好,细胞冻存的原则就是慢冻速融。
作者:
yes4
时间:
2012-4-3 17:14
熔融状态比较好,就是溶化了可是还没有全成稀液的时候
作者:
zzzz
时间:
2012-4-3 17:15
在水中边化边摇晃啊,我们实验室都是全部融化了拿去离心的。1000转5min,没有出现过任何问题。是LZ细胞冻存的时候状态不好?还是冻存时间太久?还是冻存时出现了什么问题?祝实验顺利!
作者:
skytree
时间:
2012-4-3 17:15
应该使刚好全部融化时吸出冻存管中细胞悬液到培养基中,然后去冷冻离心机中离心。
为保证该目标,应该是使用37摄氏度水浴快速融化,由于从水浴到吸出冻存管中的液体会有一定的时间,所以不能等细胞悬液全部融化,而是应该留一点点小冰茬即离开水浴,这样等到吸出液体时刚好全部融化,尽量减少了在液体状态下DMSO对细胞的损伤。
当然,如果冻存时细胞状态不好或者冻存前又或冻存中细胞损伤严重,也会导致解冻后细胞状态不佳。
作者:
loli
时间:
2012-4-3 17:18
一分钟时间左右,不要太长。
作者:
zhenxin
时间:
2012-4-3 17:19
当然是时间越短越好,细胞冻存的原则就是慢冻速融。
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我一般都是站在旁边看着的,溶有了一部分之后颠倒摇匀以加速溶。只要能把冻存液全部溶解即可。我一般都是1ML冻存的,所以复苏的时间一般也在1分钟左右。
作者:
zhenxin
时间:
2012-4-3 17:19
我一般都是站在旁边看着的,溶有了一部分之后颠倒摇匀以加速溶。只要能把冻存液全部溶解即可。我一般都是1ML冻存的,所以复苏的时间一般也在1分钟左右。
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后面的步骤一般有三种做法:
1.溶解了之后1000转离心5分钟,去除上清之后再用完全培养基将细胞重旋,最后就转到细胞培养瓶汇中。但是转速一点不能太高以免破坏细胞,因为此刻的细胞是很脆弱的。根据细胞的不一致转速要有所不同。
2.一般我是用的冻存液是含10%DMSO,我又是1ML冻存,所以就在溶解之后转移到细胞培养瓶中,同时加进9ML完全培养基,以把DMSO降到对细胞最小影响。
3.直接将溶解之后细胞转移到细胞培养瓶,根据细胞培养瓶的大小往里加入完全培养基即可。
前面两种做法都将DMSO的危害降到最低,第三种做法则没有,但是有些细胞来说也没有影响。我现在一般都是采用第二种做法。
作者:
redbutterfly
时间:
2012-4-3 17:20
我复苏的时候一般是在37℃属于中完全溶解后就转移到培养瓶中(一般是不离心的),加入完全培养基,使DMSO浓度降低到1%以下,就不会对细胞造成影响了。复苏的第二天再换上新鲜的培养基
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