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标题: [求助]下周开始做小鼠的HSCs 原代培养 [打印本页]

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:05 标题: [求助]下周开始做小鼠的HSCs 原代培养

如题
想找人学习。

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:05

Livers of 1-year-old male Wistar rats (450-500 g body mass, Interfauna), fed ad libitum on a stock diet, were perfused first with a Ca2+/Mg2+-free solution (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.6 mM NaH2P04 . 2H20, 0.8 mM NaHPO4.12H20, 10 mM Hepes, 0.5 mM EGTA, 4.2 mM NaHCO3, and 5 mM glucose, pH 7.4) for 10 min at 37°C and next with 0.05% collagenase solution (137 mM NaC1, 5.4 mM KC1, 0.6mM NaH2PO4.2H20, 0.8mM Na2HPO4.12H20, 3.8mM CaCl2, 10mM Hepes, 4.2mM NaHCO3 and 500 mg/l collagenase, pH 7.4) for 30 min at 37°C. The flow rate was 10ml/min. The digested liver was excised, dispersed in Ca2+/Mg2+-free solution and filtered through gauzes. Residual hepatocytes were removed twice by a low-speed centrifugation (50 g, 4"C, 2 min). The non-parenchy-ma1 cells were pelleted by centrifugation (450 g, 4"C, 10 min). A stellate-cell-enriched fraction was obtained by the use of centrifugation with a triple-layered (9, 11, 17%) Nycodenz cushion (1400 g, 4"C, 20 min). The cells in the upper layer were washed by centrifugation (450g, 4"C, 10min) and suspended in DMEM (GIBCO) supplemented with 10% fetal-calf serum (Boehringer Mannheim) and antibiotics (105U/1 penicillin G, 100 mg/l streptomycin, and 2.5 mg/l amphotericin . After plating, the culture medium was changed every other day.

这个是别人论文中的方法。请问小鼠的操作哪些与大鼠不同？谢谢

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:10

没有人吗？那我换个问题，

大鼠的HSC和小鼠的HSC大小差很多吗？我isolation的时候如何选择filter的pore大小？大鼠文献上用100微米的，小鼠谁知道用多少的？谢谢

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:11

再换一个问题

1. livers were perfused in situ first with EGTA solution (5.4 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 0.34 mM Na2HPO4, 0.5 mM EGTA, 25 mM Tricine, pH 7.2)(portal vein)
灌注时间？

2. then with perfusion buffer (0.075% collagenase type I in GBSS buffer with 0.02% DNase I) 灌注时间？

3. mince and digested in digestion buffer (0.009% collagenase type I in GBSS buffer with 0.02% DNase I) at 37°C for 20-30 min.

4. The homogenate was filtered(过滤网大小? Or through gauze), centrifuged at 25g for 5 min at room temperature to remove the hepatocytes.

5. The supernatant was transferred to a new tube and centrifuged at 400g for 10 min at 4°C.

6. The cell pellet was then resuspended in 5 mL of 15% OptiPrep, and loaded carefully with 5 mL of 11.5% OptiPrep, and centrifuged at 1400g for 17 min at 4°C.

7. The cell fraction in the GBSS and 11.5% OptiPrep interphase was gently aspirated, mixed with GBSS, and centrifuged at 1400g for 10 min at 4°C.

8. After another wash, the final cell pellet was resuspended in RPMI 1640 medium containing penicillin(浓度?), streptomycin(浓度?), and 20% FBS, and then plated onto 24-well plates at a density of 1 × 104 cells per well in 0.5 mL culture medium or 6-well plates at a density of 1 × 105 cells per well in 1.5 mL culture medium.

Cell number and viability were assessed by the trypan blue exclusion test

这个是我找到的最像样的方法，但是中间缺少几处关键的时间和浓度等。请问有人知道吗？谢谢。

作者: 831226 时间: 2012-4-6 15:11

楼主是那个医院的？我现在也准备做胰腺星状细胞的培养，请教GBSS就是盖氏平衡盐溶液是怎么配制的？多谢，多谢

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:14

GBSS
NaCl, 7 g,
KCl 370 mg
Na2HPO4 .2H2O 150 mg
KH2PO4 30 mg
MgCl2.6H20 376.8 mg
CaCl2.2H2O 225 mg
glucose 1 g
NaHCO3 2.27 g
Total 1 L

作者: ritou1985 时间: 2012-4-6 15:19

终于发现了一个真理，求人不如求己。终于自己搞定了。回头一看，这个帖子都是自己一个人。呵呵

_____________________________________

恭喜搞定！

能把经验总结出来，供大家学习吗？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:20

这个是我自己的protocol，有问题大家一起学习吧。因为我怕翻译不好，直接将我自己的protocol贡献出来吧。

2008-5-23 HSCs isolation

Mouse livers were perfused through

1.  The portal vein with solution I for 5 min at 37°C at a flow rate of 7 ml/min. (35ml)

2.  Each liver was then perfused solution II for 10 min at 37°C at flow rate of 7 ml/min.(70ml)

3.  The liver was excised and incubated in digest solution (30ml) at 37°C for 20 min with gentle stirring.

4.  Stop digestion with 10% FBS(+)EMEM 15ml

5.  The incubating mixture was filtered through a mesh (pore size: 70 mm).

6.  The filtrate was centrifuged at 450 g for 7 min.

7.  The cell pellet was then resuspended in 5 mL of 15% OptiPrep, and loaded carefully with 5 mL of 11.5% OptiPrep, and centrifuged at 1400g for 17 min at 4°C.

8.  The cell fraction in the upper layer of 11.5% OptiPrep was gently aspirated, mixed with GBSS (5ml), and centrifuged at 1400g for 10 min at 4°C.

9.  the cell pellet resuspend in GBSS and was centrifuged at 450 g for 7 min

10.  cell pellet was resuspended in DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics (105 U/l penicillin G, 100 mg/l streptomycin) 2ml

11.  cultured on 24 wells plastic plates at 37°C in an incubator (5% CO2/95% air).

The purity of the cultures was evaluated by examining the characteristic stellate shape of the cells with phase-contrast microscopy and by the presence of lipid droplets by autofluorescence using an excitation light of 320 nm

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:21

Solution II
137 mM NaCl  8 g
5.4 mM KCl 0.402 g
0.6 mM NaH2PO4.2H2O 0.0936 g
0.8 mM Na2HPO4.12H2O 0.2865 g
10 mM HEPES 2.383 g
3.8 mM CaCl2.2H2O 0.5586 g
4.2 mM NaHCO3　  0.3528 g
5 mM glucose 0.901 g
180 mg/l collagenase type I (使用前加,现配)
pH 7.4
Total 1L

Digest solution
solution II containing 400 mg/l pronase and 20 mg/l DNase (使用前加,现配)

GBSS
NaCl, 7 g
KCl 370 mg
Na2HPO4 .2H2O 150 mg
KH2PO4  30 mg
MgCl2.6H20 376.8 mg
CaCl2.2H2O 225 mg
glucose  1 g
NaHCO3  2.27 g
Total 1 L

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:21

贴一张HSCs的图，显微镜100倍下照的。图中左下和右下形状不规则的为HSC，上边的条状细胞形态上看像kupper。周末用alpha-SMA 免疫染色，确认HSCs。

图片附件: 98794684.snap.jpg (2012-4-6 15:21, 16.62 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11517

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:24

alpha SMA 免疫组化图
4倍

图片附件: 66992478.snap.jpg (2012-4-6 15:24, 18.2 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11518

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:25

20倍

图片附件: 90434137.snap.jpg (2012-4-6 15:25, 12.58 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11519

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:25

40倍

图片附件: 49758089.snap.jpg (2012-4-6 15:25, 20.28 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11520

作者: ending 时间: 2012-4-6 15:27

第几天的细胞？

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:27

第几天的细胞？

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14天，中间7天的时候，分了一次dish

作者: orangecake 时间: 2012-4-6 15:28

这个是我自己的protocol，有问题大家一起学习吧。因为我怕翻译不好，直接将我自己的protocol贡献出来吧。

2008-5-23 HSCs isolation

Mouse livers were perfused through

1.  The portal vein with solution I for 5 min at 37°C at a flow rate of 7 ml/min. (35ml)

2.  Each liver was then perfused solution II for 10 min at 37°C at flow rate of 7 ml/min.(70ml)

3.  The liver was excised and incubated in digest solution (30ml) at 37°C for 20 min with gentle stirring.

4.  Stop digestion with 10% FBS(+)EMEM 15ml

5.  The incubating mixture was filtered through a mesh (pore size: 70 mm).

6.  The filtrate was centrifuged at 450 g for 7 min.

7.  The cell pellet was then resuspended in 5 mL of 15% OptiPrep, and loaded carefully with 5 mL of 11.5% OptiPrep, and centrifuged at 1400g for 17 min at 4°C.

8.  The cell fraction in the upper layer of 11.5% OptiPrep was gently aspirated, mixed with GBSS (5ml), and centrifuged at 1400g for 10 min at 4°C.

9.  the cell pellet resuspend in GBSS and was centrifuged at 450 g for 7 min

10.  cell pellet was resuspended in DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics (105 U/l penicillin G, 100 mg/l streptomycin) 2ml

11.  cultured on 24 wells plastic plates at 37°C in an incubator (5% CO2/95% air).

The purity of the cultures was evaluated by examining the characteristic stellate shape of the cells with phase-contrast microscopy and by the presence of lipid droplets by autofluorescence using an excitation light of 320 nm

Solution I　
137 mM NaCl  8 g
5.4 mM KCl 0.402 g
0.6 mM NaH2PO4.2H2O 0.0936 g
0.8 mM Na2HPO4.12H2O 0.2865 g
10 mM HEPES 2.383 g
0.5 mM EGTA 0.190 g
4.2 mM NaHCO3　  0.3528 g
5 mM glucose 0.901 g
pH 7.4
Total 1L

Solution II
137 mM NaCl  8 g
5.4 mM KCl 0.402 g
0.6 mM NaH2PO4.2H2O 0.0936 g
0.8 mM Na2HPO4.12H2O 0.2865 g
10 mM HEPES 2.383 g
3.8 mM CaCl2.2H2O 0.5586 g
4.2 mM NaHCO3　  0.3528 g
5 mM glucose 0.901 g
180 mg/l collagenase type I
pH 7.4
Total 1L

Digest solution
solution II containing 400 mg/l pronase and 20 mg/l DNase

GBSS
NaCl, 7 g
KCl 370 mg
Na2HPO4 .2H2O 150 mg
KH2PO4  30 mg
MgCl2.6H20 376.8 mg
CaCl2.2H2O 225 mg
glucose  1 g
NaHCO3  2.27 g
Total 1 L

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这个方法里有个错误。吸取细胞层以后不可能用1400g这么大的离心力去沉淀细胞。这个参考文献的作者我特地写信去问过了，他承认是他们发在增补刊上的分离方法中写错了（具体文献名我不记得了，只记得文献是先发的，方法是后来增补刊的，好像是HEPATOLOGY）。应该是400g沉淀细胞，1400g梯度离心。至于其中的灌注时间，我记得酶液好像是各4分钟，文献里有讲到。我也做这个，希望和大家多讨论

作者: fsdd817 时间: 2012-4-6 15:28

楼上的你确定是密度梯度刚结束之后的离心是用400g吗？起初我也感觉用1400g对细胞活力是不是有影响？但是我看到该文通讯作者的2个文献一个是AJP的附件，一个是Hepatology的正文里都是写1400g。liangyuejin战友能把他们的回信发来看看吗？谢谢！：）

作者: fsdd817 时间: 2012-4-6 15:31

另外纠正下tk兄的图：放大倍数分别是40X、100X和400X,一般目镜是10X的。

作者: HP007 时间: 2012-4-6 15:32

相差的那张也是第14天的? 应该还没passage吧。

作者: HP007 时间: 2012-4-6 15:32

1400g没问题。

作者: jujuba 时间: 2012-4-6 15:33

1400g没问题。

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要这么大的离心力吗？我们一般离心细胞就300-500g，还请版主赐教。以前就经常向版主请教，在此先谢过了：）

作者: fsdd817 时间: 2012-4-6 15:34

不是１４５０g吗？我分过大鼠的，小鼠的不好分，楼主很强！你们用的梯度介质是什么呀？怎么铺梯度呀？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:34

这个方法里有个错误。吸取细胞层以后不可能用1400g这么大的离心力去沉淀细胞。这个参考文献的作者我特地写信去问过了，他承认是他们发在增补刊上的分离方法中写错了（具体文献名我不记得了，只记得文献是先发的，方法是后来增补刊的，好像是HEPATOLOGY）。应该是400g沉淀细胞，1400g梯度离心。至于其中的灌注时间，我记得酶液好像是各4分钟，文献里有讲到。我也做这个，希望和大家多讨论

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请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

作者: 气泡 时间: 2012-4-6 15:36

终于找到有人提取小鼠HSC了，我们最近也在做，小鼠的不好做。tk57ml 能做出上面这么好的图片非常不错。向你学习。

作者: lixi559 时间: 2012-4-6 15:36

请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

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如果这样的话，为什么不用高速离心，比如15000g呢，那样不是可以离心时间更短，更快吗，可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g，太大离心力下细胞会死吧，至于多大算大，我没做过实验，没对比过，1400g是不是大？会死多少？我也不知道，我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以，这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的，有的只用300g，甚至250g离心沉淀细胞，时间稍微长点，应该也有他们一定的道理吧。个人观点。

作者: vvmmoy 时间: 2012-4-6 15:37

要这么大的离心力吗？我们一般离心细胞就300-500g，还请版主赐教。以前就经常向版主请教，在此先谢过了：）

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我现在所在的实验室前面一个人用的差不多就是这个速度，不过，我最近改到做大鼠的450g了。

作者: lixi559 时间: 2012-4-6 15:39

关于灌注用的酶的浓度和量，有文章认为要根据不同的公司采用不同的浓度和量。而且很多参考文献中写的浓度和灌注量都有差别。
请教各位，灌注用的pronase，collagenase以及DNase大家用的是哪些公司的，用的浓度是多大，灌注Rat or mouse时灌注时间和速度分别是多少？？

作者: lixi559 时间: 2012-4-6 15:39

另外，这三个酶每次都要现配，而且用量都很少（几个mg），不知各位是怎么解决准确称量的问题。

作者: 3648755 时间: 2012-4-6 15:40

酶的用量，很多文献的说法都不同，pronase的说法是有毒性，collagenase也有文献报道会对某些细胞表面标志有影响，看你需要根据自己的实验决定浓度了。对于小鼠，灌注的速度应该要慢一点，否则，门静脉容易破。总之目的就是把肝脏灌注的烂掉，同时不能压力太大。还要，气泡不能进去，否则灌注效果很差。mg可以用精密天平称取，没有问题。

作者: fox_79 时间: 2012-4-6 15:40

如果这样的话，为什么不用高速离心，比如15000g呢，那样不是可以离心时间更短，更快吗，可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g，太大离心力下细胞会死吧，至于多大算大，我没做过实验，没对比过，1400g是不是大？会死多少？我也不知道，我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以，这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的，有的只用300g，甚至250g离心沉淀细胞，时间稍微长点，应该也有他们一定的道理吧。个人观点。

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是的，离心力大确实会机械损伤细胞。我上面的提问重点只是想说，在合理范围之内，400g离心和1400g离心，结果似乎没有太多的区别（别的细胞不知道是什么情况，最起码小鼠的HSCs上是差不多的，因为2个我都试过了），这个问题类似于到底是400g离心沉淀好，还是500g离心好。个人观点。

作者: 3648755 时间: 2012-4-6 15:40

我孤陋寡闻，没看过用1400g沉淀细胞的。不过本文献作者告知，he made a mistake.

作者: rxcc33 时间: 2012-4-6 15:41

请教各位高手，提取小鼠原代HSC时，我怎么做才能减少细胞污染？

作者: rxcc33 时间: 2012-4-6 15:45

不好意思，我可能没表达清楚，你的提HSC的PROTOCOL对我确实很有用，但我的细胞一提出来养了一天就有污染，我想问你是在什么环境中做的（超净台？），培养基用的是什么抗生素？浓度是多少？谢谢！

作者: plaa 时间: 2012-4-6 15:45

请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

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我是顺藤摸瓜从实验动物技术版摸来的。看到这么热烈的讨论，也发表一下自己的看法。
支持tk57ml,离心速度没有硬性规定。自己实践一下，比读10篇文献强得多。tk57ml 自己已经试过了，在他的实验中没有问题。如果有人只信文献，还不停地讨论文献上是如何说的，就未免太...... 即使是文献上如何说的，也需要自己实践证实一下在自己的实验条件下是否可行。

作者: yueban-1147 时间: 2012-4-6 15:46

我是顺藤摸瓜从实验动物技术版摸来的。看到这么热烈的讨论，也发表一下自己的看法。
支持tk57ml,离心速度没有硬性规定。自己实践一下，比读10篇文献强得多。tk57ml 自己已经试过了，在他的实验中没有问题。如果有人只信文献，还不停地讨论文献上是如何说的，就未免太...... 即使是文献上如何说的，也需要自己实践证实一下在自己的实验条件下是否可行。

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离心细胞通常用的离心力是300-500g，这个离心力已经可以将细胞离心沉淀下来了。过大或者过长时间的离心，会导致细胞的死亡。正是由于我不信文献，才发现英文作者的笔误。完全照搬文献，是不可取的。

作者: caihong 时间: 2012-4-6 15:47

贴一张HSCs的图，显微镜100倍下照的。图中左下和右下形状不规则的为HSC，上边的条状细胞形态上看像kupper。周末用alpha-SMA 免疫染色，确认HSCs。

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从楼主的这张图上可以看出里面混杂了不少的kupffer细胞。
我个人的体会发现11.5%的optiprep获得的细胞里含有不少kupffer细胞。
不知道楼主的纯度如何？

作者: caihong 时间: 2012-4-6 15:48

从楼主的这张图上可以看出里面混杂了不少的kupffer细胞。
我个人的体会发现11.5%的optiprep获得的细胞里含有不少kupffer细胞。不知道楼主的纯度如何？

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这是第三天的图片。（X20）其中发亮的（脂滴）为星状细胞。黑色为吞噬了碳沫的kuppfer cell。而且里面还有不少成纤维细胞？（呈长梭形，不含脂滴）
具体见下图：可见11.5%optiprep获得细胞内含有不少kupffer细胞，不知楼主是否发生类似现象。

图片附件: 27514721.snap.jpg (2012-4-6 15:48, 37.12 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11521

作者: caihong 时间: 2012-4-6 15:48

再贴一张，第7天的（X20)，也可以见到吞噬碳沫的kupffer cell 大多呈圆形或椭圆形。大部分我已用红色标出。希望能得到您的回复。

图片附件: 45272689.snap.jpg (2012-4-6 15:48, 70.27 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11522

作者: ritou1985 时间: 2012-4-6 15:48

降低optiprep的密度

作者: caihong 时间: 2012-4-6 15:49 标题: 回复 #39 ritou1985 的帖子

我分别尝试了，10.5%（1.061）；10%（1.059）；9%（1.053）三个密度，随着密度降低HSC得率下降很快，纯度并不理想。觉得降低密度并不是好的纯化方法。

作者: 66+77 时间: 2012-4-6 15:50

I will isolute HSCs.In the literatruesolation and Culture of Hepatic Stellate Cells(Ralf Weiskirchen and Axel M. Gressner),Collagenase H (0.23 U/mg) means 0.23u collagenase I to 1mg liver tissue.
thanks

作者: 66+77 时间: 2012-4-6 15:50

for isolution of HSCs,Do you had centrifugated total liver cell suspension with percoll gradient?

作者: 66+77 时间: 2012-4-6 15:51

solution I Is D-hanks?Solution II is Hanks?

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