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标题: [求助]融合蛋白细胞定位问题 [打印本页]

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:39 标题: [求助]融合蛋白细胞定位问题

构建了两个融合蛋白表达载体。转染细胞后发现荧光表达上存在有差异，是不是有蛋白定位有关？如果要进一步确定是要做共聚焦显微镜或者其他的吗？

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:39

这张是空载体的转染后绿色荧光图，绿色荧光蛋白胞核和胞浆都存在。

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作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:40

重组质粒1的转染后绿色荧光图，绿色荧光蛋白胞浆存在。

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作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:40

重组质粒2的转染后绿色荧光图，绿色荧光蛋白胞浆存在，但是胞浆内绿色的亮点处不知道是什么结构，请高人帮忙解释下。

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作者: xueyouzhang 时间: 2012-4-6 16:40

能排除报告蛋白在胞内不正常表达吗？

作者: eric930 时间: 2012-4-6 16:41

怎么排除？
这两个融合蛋白重组质粒是不同基因的，正因为这个差异，所以我可能想进一步了解下后一个蛋白的具体定位。

作者: ALALA 时间: 2012-4-6 16:41

从你所提供的图片看，质粒2更有可能是没有表达，上面的亮点更象是背景干扰。如果条件允许，可做单独表达，然后用免疫荧光的方法来对其蛋白定位进行探讨。

作者: whitesheep 时间: 2012-4-6 16:41

质粒2的肯定不是没有表达，因为我做了RT-PCR的检测，相应的mRNA的明显增高的。可能那张图不是很请清楚，我发一张低倍一点的看看

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:42

重组质粒2

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作者: nn255 时间: 2012-4-6 16:43

我也得过类似的结果.
重组1应该是包浆内表达,但不进核.
重组2其实也在包浆,那些绿点点,我觉得没必要的话,就别深究了.我也曾经做过这样的情况,然后就找各种细胞器验证啊....后来无果.这似乎是该蛋白在细胞内组成的某种大的集团.不清楚是什么结构.

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:43

呵呵，也不是一定要做深究，就是觉得有差异想了解下。估计也没时间去深究了，没几天就毕业了。

请问版主是用什么方法去验证呢？共聚焦？还是电镜?

作者: qqq111 时间: 2012-4-6 16:44

GFP载体吗？似乎空GFP载体是会形成二聚的啊，最好还是用内源性抗体染吧

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:45

但这个定位于空GFP载体的二聚体应该没什么关系吧？

作者: one 时间: 2012-4-6 16:47

GFP作为一种示踪分子，应该可以和目的蛋白形成融合蛋白，然后定位于目的蛋白所表达的位置。你可以研究一下你的目的蛋白的表达方式。比如，你的2号重组质粒所表达的蛋白可能主要就是聚点状的表达，至于定位在什么位置，也与你的目的蛋白有关~。

作者: 33号 时间: 2012-4-6 16:47

不知道质粒1和质粒2有什么关系没有，如果该蛋白或者突变体是未进行过报道的话，还是比较有意思的。质粒1，胞浆分布，大的亮点是由于瞬时转染大量蛋白表达，未能正确折叠和来不及降解而形成的聚集体（aggregate）。质粒2，胞浆分布，但该蛋白很容易形成aggregate，这与质粒1不同，可能是由于该蛋白的特性所觉得。为了了解这些蛋白的特性，还需要进行以下实验。1. 更换不同的细胞进行表达。2. 更换GFP tag换成更小的tag，如myc，flag，HA等进行免疫荧光定位。3.筛选稳定表达克隆或者降低转染的质粒，使得表达量降低，再进行观察，看质粒2是否也存在大量的aggregate。以上是在没有很好的内源性抗体的前提下进行的研究。如果质粒2是质粒1的突变体，质粒2可能更有研究的意义。

作者: 8princess8 时间: 2012-4-6 16:48

加各种细胞器的燃料做共聚焦.可惜,最后没一个成的.
毕业论文你说可以说,也可以忽悠但我真的推荐如果在没多少时间的情况下,不要去深究了

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:49

质粒1和质粒2没有什么联系的。

此外，质粒2里面的亮点的多少以及亮度好像是与该蛋白的表达有关。

因为我替换过载体上的启动子，本身的启动子效率比较高，蛋白表达越高亮点就越多、越亮；

而我替换了的启动子后，启动效率相对较低，荧光强度比较低、亮点比较小，可能就是如gunzi战友所说与该蛋白的共聚体有关。
未替换启动子的重组质粒2图片附上：

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作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:49

替换了的启动子的重组质粒2图片如下：

图片附件: 90184624.jpg (2012-4-6 16:49, 19.93 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:50

论文和答辩都弄完了，论文里没有去提及这个方面，应为重组质粒1不是我论文的内容，所以没有对比我就没有去提及了，答辩的时候也没人在意这个现象，呵呵。

这个应该不会去深究了，没几天就要授予学位了。。。

作者: gogo 时间: 2012-4-6 16:50

呵呵,恭喜恭喜!这样的现象应该是跟细胞的自身蛋白表达系统有关.甚至一些融合蛋白出现的新的定位也不得而知.如果将来成大牛了,倒是可以回来再想想,可惜现在我们真的没时间和精力去做,否则谁愿意养你?嘿嘿

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-4-6 16:51

楼上群友说的是，环境有时候让我们无能为力。。。

最后向老板汇报下好了，然后要怎么做就随老板自己了。

作者: 04906 时间: 2012-4-6 16:51

跟我遇到的情况类似，我怀疑质粒2表达的蛋白定位于胞浆，聚集于高尔基体或是粗面内质网等细胞器，然后转运，分泌出去。

可以做个流式表面染色或者胞内染色检测一下。

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