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标题: [讨论帖]Transwell技术答疑 [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:14 标题: [讨论帖]Transwell技术答疑

Transwell技术作为细胞生物学的常用实验方法，在生物医学研究领域有着极其广泛的应用。

虽然只是一个带有通透膜的小杯，transwell却在免疫、药理、肿瘤等多方面的研究中起到不可替代的作用，充分了解transwell的作用并且正确使用经常决定着接下来实验的成败。

本人有多年的transwell技术经验，特开transwell技术答疑园地，对群友们提出的问题给予解答，希望能够和大家相互学习，共同进步。

任何与transwell有关的实验问题和产品问题，大家尽管在此提出，本人尽力解答，也欢迎群友们来参加讨论。

再次感谢大家。

作者: redbutterfly 时间: 2012-4-7 09:15

一个问题：有介绍说在包被滤膜时，需要用DMEM或者其他的无血清培养基稀释Matrigel胶，如从10mg/ml to 5mg/ml。这一步是必须的吗? 可以将胶4°C 溶成液态后直接就包被吗？
另外，所谓的水化滤膜是不是在接种细胞前进行？谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:15 标题: 回复 #2 redbutterfly 的帖子

当我们进行肿瘤细胞侵袭试验的时候，常常要把细胞种在上腔，下腔中则加入血清或者一些相应的趋化因子，同时，在通透膜上腔面包被上基质胶（Matrigel胶）模拟细胞外基质。这样，肿瘤细胞受到下腔物质趋化而向下运动，必须先分泌基质金属蛋白酶（MMPs)来降解Matrigel胶，然后透过通透膜，进入下腔。

当肿瘤细胞分泌的MMPs,Matrigel胶的浓度和厚度，下腔的趋化因子强度达到一种适合的关系的时候，借助于transwell的侵袭试验是便于操作和评价的。

换言之，如果Matrigel胶浓度太大或者涂得太厚，则不容易评价肿瘤细胞的侵袭作用。因此，一般要对Matrigel胶做一定比例的稀释，具体浓度应当考虑您所用的肿瘤细胞分泌的MMPs的情况和下腔设置的趋化因子的情况后确定。

水化滤膜（通透膜）应当在种细胞前进行。

作者: glass 时间: 2012-4-7 09:16

我将用Corning的Transwell的培养板，培养细胞时是细胞贴壁在中间的虑漠上，我的目的蛋白大约为25KDa，不知选择虑膜孔径为多大合适，如太大了，会将细胞漏下去，太小了细胞生产的蛋白通不过滤膜，到不了下层？请问谁有这方面的经验，希望能够分享一下！细胞为PK15细胞，蛋白为牛生长激素，请问细胞直径一般为多大，像分子量约为25KDa的蛋白折叠后直径大约为多少微米？

作者: windy+++ 时间: 2012-4-7 09:16

不会吧，蛋白很小很小，到不了微米的级别吧？一般做趋化因子在细胞间相互作用的，可以用0.4um孔径的，如果做细胞迁移的，用3um或8um的。不用考虑蛋白跑不过来：）

作者: c86v 时间: 2012-4-7 09:17

请教transwell通透膜种类选择的问题。
我用于细胞共培养，检测细胞因子对下层细胞的影响，我选择了0.4um的膜。因为上层细胞是造血细胞（悬浮），似乎对细胞的粘附要求不高。请问这种情况膜材料的选择是PET,还是PC更好一些？如果是贴壁的细胞，情况又是如何呢？感谢解惑！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:18 标题: 回复 #6 c86v 的帖子

正如版主所说，一般不认为transwell的滤膜会限制蛋白运动。如果是为了进行共培养，多选用0.4微米孔径，这样分泌的蛋白可以透过，而细胞不会漏下去。至于细胞直径，目前还没有报道有真核生物的完整细胞小于1微米。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:18

请教transwell通透膜种类选择的问题。
我用于细胞共培养，检测细胞因子对下层细胞的影响，我选择了0.4um的膜。因为上层细胞是造血细胞（悬浮），似乎对细胞的粘附要求不高。请问这种情况膜材料的选择是PET,还是PC更好一些？如果是贴壁的细胞，情况又是如何呢？感谢解惑！

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聚酯(PET)Transwell-的特点是其滤膜在显微镜下呈透明状态，这样细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态。
而聚碳酯(PC)Transwell的膜则呈半透明状态，不容易在镜下观察细胞。

如果是用于共培养目的，您选0.4微米孔径是恰当的，至于选PET还是PC，还是要根据您的实验目的来定。

如果您在上层种上贴壁细胞，也是可以的。个人曾经这样干过，上层和下层都种了贴壁细胞，我的实验目的希望能够同时观察两种细胞的生长情况，就选用了透明的PET膜。观察细胞的时候可以调节显微镜的焦距分别观察上层和下层的细胞状态。

作者: sunnyB 时间: 2012-4-7 09:19

我想请教一下，在小鼠干细胞迁移实验中，一般选择多大孔径的膜，5ul还是8ul？观察的时间一般是几个小时？4hrs还是更长一些？如果加入的是LSK细胞（干祖细胞），上孔的细胞数多少比较合适呢？谢谢。

作者: one 时间: 2012-4-7 09:19

求助班主：我近期在用traswell做一种细胞对另一种细胞迁移的影响实验，我用的是Corning 8um的膜，可染色方面出了问题。前期我一直用苏木素染色方法。具体步骤是：用棉签擦去滤膜上室面的细胞，然后将Transwell insert置入95％乙醇中固定10min，苏木素染色5～10min，l％盐酸酒精脱色数秒，流水冲洗，使细胞核染蓝，取下滤膜，下室面朝上平铺于载玻片上，显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的SMC，每个样本计数5个高倍视野(400HPF)的细胞数取平均值，测定SMC迁移率。但染色后发现细胞颜色非常浅（显微镜怎么调都看不清楚），几乎看不见颜色，我用同样的方法染色细胞爬片，发现效果很好。不知问题出在哪地方了？附图：。。。
最近我又换了结晶紫的染色方法。首先结晶紫的配制方法：称0.1g 结晶紫先加几毫升酒精溶1下然后溶解到100ml蒸馏水中，避光备用（不知道是不是我配制的方法不对）。染色步骤：细胞用甲醛室温固定30分钟，清水冲洗，膜风干。结晶紫染色10分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。但我发现染色后整个膜都是紫色的，用水根本洗不掉（洗的太猛又怕把细胞洗掉），上显微镜也观察不到细胞了，整个界面全是紫色的。不知问题出在哪？很是焦急？恳请指导
小弟还想请教一下关于迁移率的计算方法？万分感谢

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11532

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:20

我想请教一下，在小鼠干细胞迁移实验中，一般选择多大孔径的膜，5ul还是8ul？观察的时间一般是几个小时？4hrs还是更长一些？如果加入的是LSK细胞（干祖细胞），上孔的细胞数多少比较合适呢？谢谢。

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请问您说的干细胞是造血干细胞（HSC)还是间充质干细胞(MSC)或者是其它的干细胞？如果是悬浮细胞如HSC一般选用5微米孔径的滤膜，如果是MSC我们一般选用8微米孔径的滤膜。观察的时间还是要和您的实验设计相关，以能最大程度体现各个实验组之间的差异为宜。如果没有文献可以参考，您可以把其它因素（如下腔趋化因子或者血清的浓度，下腔的细胞数量，上腔的细胞数量等）固定，然后拉时间点比如2小时，4小时，6小时，8小时，分别收细胞，选取最为满意的时间点。
至于上腔加入多少细胞如LSK，可以根据文献另外结合自己的实验设计来定。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 09:20

求助班主：我近期在用traswell做一种细胞对另一种细胞迁移的影响实验，我用的是Corning 8um的膜，可染色方面出了问题。前期我一直用苏木素染色方法。具体步骤是：用棉签擦去滤膜上室面的细胞，然后将Transwell insert置入95％乙醇中固定10min，苏木素染色5～10min，l％盐酸酒精脱色数秒，流水冲洗，使细胞核染蓝，取下滤膜，下室面朝上平铺于载玻片上，显微镜下照相并计数迁移到滤膜下室面的SMC，每个样本计数5个高倍视野(400HPF)的细胞数取平均值，测定SMC迁移率。但染色后发现细胞颜色非常浅（显微镜怎么调都看不清楚），几乎看不见颜色，我用同样的方法染色细胞爬片，发现效果很好。不知问题出在哪地方了？附图：。。。
最近我又换了结晶紫的染色方法。首先结晶紫的配制方法：称0.1g 结晶紫先加几毫升酒精溶1下然后溶解到100ml蒸馏水中，避光备用（不知道是不是我配制的方法不对）。染色步骤：细胞用甲醛室温固定30分钟，清水冲洗，膜风干。结晶紫染色10分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。但我发现染色后整个膜都是紫色的，用水根本洗不掉（洗的太猛又怕把细胞洗掉），上显微镜也观察不到细胞了，整个界面全是紫色的。不知问题出在哪？很是焦急？恳请指导
小弟还想请教一下关于迁移率的计算方法？万分感谢

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其实利用transwell观察细胞迁移的实验方法都大同小异，基本上是迁移、擦去上腔面细胞，染色，镜下多视野拍照计数，计算迁移率。其中染色方法很多：苏木素染色、结晶紫染色、Giemsa染色、伊红染色和台盼蓝染色等等。其中各个染色液的配制和染色方法的使用根据各实验室的习惯多有变化，因此，也造成结果的不稳定性。
您提到的问题我也遇到过，因为多个环节可能影响到最终的结果，所以我们实验室现在已经不用以上方法。一般在迁移后，用棉签轻轻擦去滤膜上腔面细胞，甲醇固定15min后，晾干，DAPI染色30min，荧光显微镜下随机挑取5~8个视野，照相，计数，并统计学分析。效果非常的好，照片也比较好看。

如果细胞穿过滤膜进入下腔，则迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%；
如果是对滤膜下腔面的贴壁细胞染色，则可以比较各实验组每视野内的细胞数量。

作者: cocacola 时间: 2012-4-7 09:21

我想请问，用棉签擦的时候应该注意些什么呢？直接用干的棉签擦吗？如何保证上面的细胞都被擦去了呢？如果用Matrigel胶的话，我觉得边缘的胶很难被擦去，请问怎么处理呢？谢谢！

作者: xingyi08 时间: 2012-4-7 12:37

各位前辈:
小弟咨询个问题,我是做血脑屏障模型的,看到有的文献用的transwell直径为1um,有的是0.4um的!还有其他的!请问各位前辈这有什么区别!血脑屏障模型的建立,最好使用哪种的transwell?
请各位给小弟指导!感激感激!

作者: u234 时间: 2012-4-7 12:41

lss的，可以买到尖头的棉签，可以擦到角落的：）当然边角总不是很可信，拍照还是拍中间。

作者: yychen 时间: 2012-4-7 12:41

如果我要做药物干预肿瘤细胞的迁移作用，应该怎么做呢？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:42

我想请问，用棉签擦的时候应该注意些什么呢？直接用干的棉签擦吗？如何保证上面的细胞都被擦去了呢？如果用Matrigel胶的话，我觉得边缘的胶很难被擦去，请问怎么处理呢？谢谢！

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呵呵，干湿棉签都可以。用棉签擦的时候要小心，力气太猛会把滤膜弄坏。如果是擦边上，个人的经验一般是自己用棉花卷一个小小的棉签，仔细地擦。另外，正如版主说得那样，一般取视野拍照很少取边缘部位的。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:42

各位前辈:
小弟咨询个问题,我是做血脑屏障模型的,看到有的文献用的transwell直径为1um,有的是0.4um的!还有其他的!请问各位前辈这有什么区别!血脑屏障模型的建立,最好使用哪种的transwell?
请各位给小弟指导!感激感激!

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一般认为，血脑屏障主要由血管内皮细胞、基膜、胶质细胞组成，胶质细胞可以通过终足与内皮细胞相联系。其中，内皮细胞及其间的紧密连接是血脑屏障机能与结构的主要基础。因此，通常先将星形胶质细胞接种于transwell滤膜的反面，待胶质细胞贴牢后，再将内皮细胞接种于微孔膜正面，使胶质细胞可以通过微孔与内皮细胞系形成接触式共培养。
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，所以从这个角度来说，选择0.4微米和1微米的孔径都可以；如果从充分形成细胞间接触的角度来说，1微米孔径可能更好一些。

作者: ladyhuahua 时间: 2012-4-7 12:43

版主您好：我想用coning公司的transwell小室做做肿瘤细胞实验，包括粘附、迁移、侵蚀、成血管检测，想请问这些实验都可以使用transwell小室吗？他们之间的操作有什么区别啊？谢谢

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:43

如果我要做药物干预肿瘤细胞的迁移作用，应该怎么做呢？

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肿瘤细胞的趋化试验通常是在上腔种上肿瘤细胞，下腔加入特定的趋化因子或者是血清，细胞会向有趋化作用的因子所在的下腔迁移，对掉入下腔的细胞进行计数或者流式分析，或者对迁移到滤膜下腔面的细胞染色、计数、分析，以此观察细胞的迁移能力。
如果是考察药物干预肿瘤细胞的迁移作用，通常的策略是用药物对肿瘤细胞进行预处理，然后收细胞，种到上腔内，进行迁移试验。具体的细节比较多，如药物处理的时间和浓度，既要能改变细胞的迁移能力，又不杀伤细胞或者诱发凋亡；加入到上腔的细胞数量和下腔内趋化因子浓度是否相适应，等等。需要根据您的细胞特性和实验目的来决定。

作者: ero11 时间: 2012-4-7 12:44

我还想请问一下boyden chamber实验和迁移、侵蚀实验的区别？他们只是名字的不同吗？

作者: 00无名指00 时间: 2012-4-7 12:44

大家好，我希望我要研究的细胞长在膜的上下两侧，这两种细胞都是贴壁细胞，如何让下层的细胞贴在膜上而不是六块板底呢？不甚感激！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:45

大家好，我希望我要研究的细胞长在膜的上下两侧，这两种细胞都是贴壁细胞，如何让下层的细胞贴在膜上而不是六块板底呢？不甚感激！

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可以先把transwell小室倒置，细胞悬液滴在滤膜的下腔面，待4-6小时后，细胞已经基本贴壁牢固，然后再把小室正常放置到六孔板内，在滤膜上面种上另外一种细胞即可。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:45

版主您好：我想用coning公司的transwell小室做做肿瘤细胞实验，包括粘附、迁移、侵蚀、成血管检测，想请问这些实验都可以使用transwell小室吗？他们之间的操作有什么区别啊？谢谢

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transwell的应用范围很广，您可以从下面的表格里面看到其应用的例子：

常用的操作的差别如下：1、细胞共培养试验
通透膜的孔径小于一定尺寸，细胞无法通过而培养基可以自由流动，因此，可以借助一定孔径的tranwell进行共同培养试验，考察无细胞接触时，分泌性因素对不同的细胞的作用。
2、细胞趋化试验：
根据细胞的大小选用不同孔径通透膜的transwell小室，上腔内的细胞可穿过膜进入下腔，如果是悬浮细胞，则对进入下腔的细胞计数，如果是贴壁细胞，则用棉签擦去通透膜上腔面的细胞，然后对通透膜下腔面的细胞进行染色，然后计数。进入下腔的细胞量可反映下腔内的细胞或者是因子对上腔细胞的趋化能力。
3、细胞迁移试验：
与细胞趋化试验相似，常常在上腔种上细胞，下腔加入特定的趋化因子、药物或者是血清，细胞会向有趋化作用的因子所在的下腔迁移，对下腔的细胞计数，分析，观察细胞的迁移能力。
4、肿瘤细胞侵袭试验
transwell侵袭实验就是在transwell的通透膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，细胞要把部分基质分解才可以通过通透膜，到达有含有趋化因素的下腔。

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作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:46

我还想请问一下boyden chamber实验和迁移、侵蚀实验的区别？他们只是名字的不同吗？

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boyden chamber实验是检查肿瘤迁移，侵袭试验的方法之一，具体操作：首先将Matrigel胶置4℃融化，并用无血清培养基将稀释混匀，用枪尖涂到至Boyden小室的上室聚碳酸酯膜上，整个操作在冰上及无菌条件下进行。涂好后移到37度，此时Matrigel已经形成胶。在Boyden小室的
下室内加入趋化因子，上室加入肿瘤细胞，放于培养箱内，分别在不同时间点（2h,4h,6h，8h,等）检测。弃去上腔中的培养液，并用棉签擦去滤膜上腔面细胞，染色，计数，拍照。
附上Boyden小室的图片。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11534

作者: lixi559 时间: 2012-4-7 12:46

非常感谢版主耐心细致的解答，收益匪浅！我还想问一个问题：肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞共培养的时候研究肿瘤细胞对内皮细胞成血管作用，我把肿瘤细胞放入下室，内皮细胞放入底部铺有基质胶的上室中，想请问，肿瘤细胞或者内皮细胞的培养液可以透过基质胶吗？或者是我直接将肿瘤细胞和内皮细胞混合养？

作者: 987789 时间: 2012-4-7 12:47

版主您好：我现在在用coning公司的transwell小室做对单核细胞的趋化等，特向您请教：目前预实验用单核细胞系THP-1细胞做趋化，这个细胞没有用PMA诱导是悬浮细胞，趋化结束后发现膜下面也有少许细胞附着，这些细胞需要计入进入下室的总细胞数吗？对于这类悬浮细胞，进入下室的细胞计数方法有什么好办法呢？可以用MTT来计算吗？另外你对于贴壁细胞用DAPI染色，染色前用的是纯甲醇固定吗？非常感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:47 标题: 回复 #27 987789 的帖子

请问您的实验目的是什么呢？是考察细胞分泌因素或者表明分子之间的调节作用吗？人脐静脉内皮细胞分离培养扩增都不需要用基质胶的，直接种即可。如果是考察细胞分泌因素的作用，可以一种细胞种板底，一种种滤膜上腔面，如果还想考察接触因素，可以把细胞分别种在滤膜的两面。直接把细胞混养好像不太合适。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:48

版主您好：我现在在用coning公司的transwell小室做对单核细胞的趋化等，特向您请教：目前预实验用单核细胞系THP-1细胞做趋化，这个细胞没有用PMA诱导是悬浮细胞，趋化结束后发现膜下面也有少许细胞附着，这些细胞需要计入进入下室的总细胞数吗？对于这类悬浮细胞，进入下室的细胞计数方法有什么好办法呢？可以用MTT来计算吗？另外你对于贴壁细胞用DAPI染色，染色前用的是纯甲醇固定吗？非常感谢！

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非常高兴能和您共同学习。
1、膜下面也有少许细胞附着，这些细胞需要计入进入下室的总细胞数吗？
个人认为如果这部分细胞数量所占比例较少，而且不是实验设计中的考察因素，那么可以视为各组的均一背景，不计数。
2、对于这类悬浮细胞，进入下室的细胞计数方法有什么好办法呢？可以用MTT来计算吗？
一般就是进行直接细胞计数或者采用流式分析和计数，用MTT间接分析也可以。
3、另外你对于贴壁细胞用DAPI染色，染色前用的是纯甲醇固定吗？

作者: lixi559 时间: 2012-4-7 12:48

请问您的实验目的是什么呢？是考察细胞分泌因素或者表明分子之间的调节作用吗？人脐静脉内皮细胞分离培养扩增都不需要用基质胶的，直接种即可。如果是考察细胞分泌因素的作用，可以一种细胞种板底，一种种滤膜上腔面，如果还想考察接触因素，可以把细胞分别种在滤膜的两面。直接把细胞混养好像不太合适。

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我想研究肿瘤细胞分泌的因子对内皮细胞刺激作用，促进内皮细胞在基质胶上形成血管的研究，要用到共培养，想问问怎么样设计细胞的位置？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:49

成管是要用到基质胶，可是把内皮加基质胶再和肿瘤细胞长时间共培养，不知道行不行。
如果是考察分泌的因子的作用，可以收肿瘤细胞的培养上清，超滤，加到成管体系中去。

作者: lixi559 时间: 2012-4-7 12:49

在做肿瘤细胞迁移实验的时候在transwel小室上室底部铺有鼠尾I型胶原或基质胶，请问，肿瘤细胞能透过I型胶原或者基质胶吗？如果不能的话，肿瘤细胞怎么迁移的？怎么又能观察8um透过膜对侧的细胞呢？如果能的话那又和肿瘤细胞侵蚀实验有什么区别？我的实验还处在设计阶段，很多都不懂，请您多多指教，非常感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:50 标题: 回复 #32 lixi559 的帖子

您的问题很好。
细胞迁移试验不用铺基质胶的，如果是肿瘤细胞侵袭试验要铺基质胶模拟细胞外基质，肿瘤细胞分泌一些酶如MMPs,分解基质胶，穿过滤膜。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-4-7 12:50

版主您好：我用coning公司的transwell小室 3422型做肿瘤侵袭实验，胶买的是BD公司的，自己铺胶，做了三次，发现细胞都不是均匀铺在下室，成团现象，而不铺胶做迁移试验细胞穿过得很均匀。想问一下铺胶有什么技巧，避免这种现象发生。

作者: lixi559 时间: 2012-4-7 12:50

冒昧再次打扰版主，还是咨询肿瘤细胞迁移实验的时候要不要包被胶原或基质胶以及细胞能否穿过的问题，后来我查阅了很多文献，很多作者在做迁移实验的时候都有这样一段描述："聚碳酸酯滤膜用0．01％的I型胶原包被过夜，晾干备用"。
而你说的一搬不用包被胶原或者基质胶，我想请问，是包被好还是不包被好，不包被能说明问题吗？非常感谢！

作者: BOSS2011 时间: 2012-4-7 12:51

版主您好：
已经确定要做肿瘤细胞的侵袭实验，您的这个帖子真是个及时雨，之前也看了很多有关Transwell的帖子，有所收获，但是因为左说纷纭，每个人的protocol并不是一致，所以想请教您几个问题。
第一，是否可以选择coring的transwell货号（3422）做侵袭实验？transwell3422是否要包胶？代理商说不需要，但是看了很多文章还是需要包matrigel的。
第二，BD的matrigel有很多货号，比如356234（Basement Membrane Matrix）和356230（Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced),不知如何选择？
有人说matrigel原胶是50mg/ml，但是就没看到BD说明书上描述胶的浓度，只是告诉5ml。
第二，稀释比列有人说1：2，1：4，1：8，个人感觉总得来说1：4多些。
第三，24孔板的每个transwell小室放多少微升胶，我看有的人说加了再吸出来，个人倾向加30微升，37°培养箱过夜干燥。
刚接触Transwell的侵袭实验，对此很陌生，因为做一次成本比较高，所以比较谨慎，不知您对我的问题有何见解，谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2012-4-7 12:52

请问版主：Transwell板可不可以重复利用？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:52

冒昧再次打扰版主，还是咨询肿瘤细胞迁移实验的时候要不要包被胶原或基质胶以及细胞能否穿过的问题，后来我查阅了很多文献，很多作者在做迁移实验的时候都有这样一段描述："聚碳酸酯滤膜用0．01％的I型胶原包被过夜，晾干备用"。其中一篇原文附下。
而你说的一搬不用包被胶原或者基质胶，我想请问，是包被好还是不包被好，不包被能说明问题吗？非常感谢！

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非常感谢您提供的信息，结合您前面的帖子，个人有几点疑问：
您是做细胞迁移试验还是侵袭试验？
用的是transwell还是Boyden小室？
准备铺胶原还是matrigel胶？
用的是肿瘤细胞还是？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:53

请问版主：Transwell板可不可以重复利用？

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呵呵，某些情况下可以，个人用0.4和5微米的膜，上层放T或者DC，发现用PBS冲冲，超声洗下，酒精泡泡还是可以再用一次的，个人经验不作为推广啊。不过如果是做贴壁细胞的迁移，染膜之后就没法重复用了。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:55

版主您好：我用coning公司的transwell小室 3422型做肿瘤侵袭实验，胶买的是BD公司的，自己铺胶，做了三次，发现细胞都不是均匀铺在下室，成团现象，而不铺胶做迁移试验细胞穿过得很均匀。想问一下铺胶有什么技巧，避免这种现象发生。

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个人手法，见仁见智。铺胶全过程在冰上操作，连续涂胶，涂完后稍微放一放，再放到培养箱。也有人把稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl 直接加到膜上放培养箱。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:56

版主您好：
已经确定要做肿瘤细胞的侵袭实验，您的这个帖子真是个及时雨，之前也看了很多有关Transwell的帖子，有所收获，但是因为左说纷纭，每个人的protocol并不是一致，所以想请教您几个问题。
第一，是否可以选择coring的transwell货号（3422）做侵袭实验？transwell3422是否要包胶？代理商说不需要，但是看了很多文章还是需要包matrigel的。
第二，BD的matrigel有很多货号，比如356234（Basement Membrane Matrix）和356230（Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced),不知如何选择？
有人说matrigel原胶是50mg/ml，但是就没看到BD说明书上描述胶的浓度，只是告诉5ml。
第二，稀释比列有人说1：2，1：4，1：8，个人感觉总得来说1：4多些。
第三，24孔板的每个transwell小室放多少微升胶，我看有的人说加了再吸出来，个人倾向加30微升，37°培养箱过夜干燥。
刚接触Transwell的侵袭实验，对此很陌生，因为做一次成本比较高，所以比较谨慎，不知您对我的问题有何见解，谢谢！

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非常感谢您的问题。
正如您所说，每个人的protocol并不是一致，所以就您的问题谈一下个人观点。
个人认为3422做侵袭还是要包matrigel胶的。
356234里面包括了一些细胞因子如TGF-beta,FGF等，如果你的实验就是要考察一些相关的因子的作用，要考虑到这一点。356230里面去除了大多数细胞因子，避免了matrigel胶的因素影响结果。
的确，BD没有告诉具体浓度，一般是按照比例稀释，如果想了解，可以接触他们技术支持，稀释比例也涉及到个人习惯，个人感觉如果太浓，胶容易不平，4倍或8倍都可以接受。
BD的matrigel胶不便宜，而且胶太厚了也不好用，所以以薄薄覆盖为宜，20-30微升都可以。

欢迎多交流。

作者: qqq111 时间: 2012-4-7 12:57

问个小问题
使用白色膜做实验怎么观察，用哪种染色？特别是苏木精染色能染上吗？Ehrlich苏木精？

作者: hulu呼噜 时间: 2012-4-7 12:58

非常感谢版主讲解，感觉你是道中高手啊！轻描淡写，四两拨千斤！心中有数了！
再问个弱智问题，水化时和上室加细胞悬液是用无血清培养基还是1%血清培养基，下室用20%的培养基可否？
再次感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 12:59 标题: 回复 #43 hulu呼噜的帖子

感谢您的问题。
个人觉得水化和上室加细胞悬液以1%的BSA为好，下室趋化一般用5-10%的FBS，如果您的细胞趋化能力强，浓度可以低些，反之，FBS浓度可以高些，所以最好查文献，看看您的细胞特性，或者，做个预实验。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:00

问个小问题
使用白色膜做实验怎么观察，用哪种染色？特别是苏木精染色能染上吗？Ehrlich苏木精？

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染膜的方法很多：包括苏木素染色及其各种改良法、结晶紫染色、Giemsa染色、伊红染色和台盼蓝染色等等。个人觉得DAPI染色，荧光显微镜下看，效果比较好。

作者: hulu呼噜 时间: 2012-4-7 13:00

再次感谢版主的解答。请问版主，1%BSA是bovine serum albumin（牛血清白蛋白）吗？有的文献是说0.1%的BSA，也就是100ml的培养基中加0.1克的BSA了？

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-4-7 13:01

近期准备做Transwell 观察药物对小鼠骨髓来源的树突状细胞迁移的影响
因为周围没什么人做过想请教一下该选用什么材料的孔径多大的膜
谢谢树突状细胞是悬浮生长的

作者: 2541 时间: 2012-4-7 13:01

请问，心肌细胞株和预处理过的MSCs共培养，想研究预处理过的MSC的旁分泌作用对心肌细胞凋亡的影响。transwell，共同培养基，所以不知道会不会有双侧渗透的细胞因子影响？如何避免呢？
还有，我想问一下是不是上为干细胞，下为心肌细胞呢？
谢谢您。

作者: windy+++ 时间: 2012-4-7 13:01

BSA就是牛血清白蛋白，0.1%到1%都有人用的，具体要看你的实验体系。
加了BSA以后，要用0.22um的滤膜过滤一下。

作者: windy+++ 时间: 2012-4-7 13:02

问个小问题
使用白色膜做实验怎么观察，用哪种染色？特别是苏木精染色能染上吗？Ehrlich苏木精？

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我们一般用结晶紫染色

作者: lixi559 时间: 2012-4-7 13:02

非常感谢您提供的信息，结合您前面的帖子，个人有几点疑问：
您是做细胞迁移试验还是侵袭试验？
用的是transwell还是Boyden小室？
准备铺胶原还是matrigel胶？
用的是肿瘤细胞还是？

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因为问的东西多，所以有点乱，我的回答是：
1、我想做细胞迁移、侵蚀、成血管实验都做；
2、我想用transwell小室做，但发现boyden小室也可以，不知道他们之间的区别，哪个好？迷茫中...
3、我胶原和基质胶都要铺，用在成血管试验中，就像你描述的，transwell小室的一面种内皮细胞，一面种肿瘤细胞；
4、当然主要是用肿瘤细胞来做实验。

作者: cocacola 时间: 2012-4-7 13:03

transwell小室、boyden小室和millicell有什么区别？

作者: 33号 时间: 2012-4-7 13:03

你好，我想请教，最近看了篇文献讲应用transwell侵袭实验筛选出转移能力强的肿瘤细胞，通过十轮的transwell侵袭实验，最终从原始肿瘤细胞系筛选出高转移能力的亚系。请问，如何在transwell侵袭实验后收集细胞继续培养而不污染？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:03

近期准备做Transwell 观察药物对小鼠骨髓来源的树突状细胞迁移的影响
因为周围没什么人做过想请教一下该选用什么材料的孔径多大的膜
谢谢树突状细胞是悬浮生长的

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呵呵，原来是DC同道，个人用的是5微米的膜，透明不透明都可以。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:04

请问，心肌细胞株和预处理过的MSCs共培养，想研究预处理过的MSC的旁分泌作用对心肌细胞凋亡的影响。transwell，共同培养基，所以不知道会不会有双侧渗透的细胞因子影响？如何避免呢？
还有，我想问一下是不是上为干细胞，下为心肌细胞呢？
谢谢您。

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感谢您的问题。个人理解:transwell培养的时候，MSC和心肌细胞共同培养的作用，应该是一种cross-talk式的作用，及MSCs分泌的因子作用于心肌细胞，而心肌细胞分泌的因子也反作用于MSC。如果您只想考察MSCs的分泌性因素对心肌细胞的作用，应当收集MSCs的培养上清，超滤，然后添加到心肌细胞培养体系中。
至于MSCs和心肌细胞谁上谁下，好像不重要，除非您的实验目的有特殊要求。

作者: tianmei001 时间: 2012-4-7 13:05

呵呵，原来是DC同道，个人用的是5微米的膜，透明不透明都可以。

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呵呵巧了巧了是不是就直接对下腔的细胞计数用细胞计数板吗？
谢谢

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:05

因为问的东西多，所以有点乱，我的回答是：
1、我想做细胞迁移、侵蚀、成血管实验都做；
2、我想用transwell小室做，但发现boyden小室也可以，不知道他们之间的区别，哪个好？迷茫中...
3、我胶原和基质胶都要铺，用在成血管试验中，就像你描述的，transwell小室的一面种内皮细胞，一面种肿瘤细胞；
4、当然主要是用肿瘤细胞来做实验。
不知道我这样回答是不是连贯一点了？

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感谢您的问题。
transwell和boyden的结构大都是滤膜、上腔和下腔，如果非要说哪个好，个人感觉transwell的种类多一些，可选余地大；
一般包被胶原主要是方便细胞的粘附，而transwell大都经过特殊处理，个人感觉细胞贴附很好，当然每个个人习惯和试验目的不一样，
做内皮成管是要铺matirgel胶的，和铺胶原的目的不一样；

以上仅仅是个人看法，具体实验设计要和您的实验目的结合，要和导师一起定。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:06

transwell小室、boyden小室和millicell有什么区别？

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直接一点说，这三者都是带孔的滤膜及其分隔出来的上腔和下腔。Corning管他们的产品叫transwell,millipore管他们的叫millicell,这两者都是一种类似于小杯子状的结构，都要配合培养板使用，boyden是一种独立的小室。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:06

你好，我想请教，最近看了篇文献讲应用transwell侵袭实验筛选出转移能力强的肿瘤细胞，通过十轮的transwell侵袭实验，最终从原始肿瘤细胞系筛选出高转移能力的亚系。请问，如何在transwell侵袭实验后收集细胞继续培养而不污染？

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感谢您的问题。
这篇文献很有意思，您方便贴出来看看嘛？
收集细胞可以用胰酶消化，无菌操作即可。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:06

呵呵巧了巧了是不是就直接对下腔的细胞计数用细胞计数板吗？
谢谢

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可以用计数板直接计数，也可以用流式计数。

作者: toy 时间: 2012-4-7 13:07

正好在此问一个问题：我在做表皮细胞的复层培养，需要气液界面培养方法，不知气液界面培养时，transwell下面的6孔板准确一些需要加多少培养液？2ml？

作者: 3648755 时间: 2012-4-7 13:07

BSA就是牛血清白蛋白，0.1%到1%都有人用的，具体要看你的实验体系。
加了BSA以后，要用0.22um的滤膜过滤一下。

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多谢版主的回答，不知怎么个具体看实验体系？我的实验体系就是做肿瘤细胞Transwell侵袭实验，上室铺matrigel胶然后加肿瘤细胞，下室加10%FBS的培养基。
还有一个问题就是matrigel是无菌的吧，用无菌的培养基稀释，凝固了水化后直接可以用吧？
初次做Transwell，不敢贸然下手，多谢指导！谢谢！

作者: toy 时间: 2012-4-7 13:08

多谢wlnju的回答，不知怎么个具体看实验体系？我的实验体系就是做肿瘤细胞Transwell侵袭实验，上室铺matrigel胶然后加肿瘤细胞，下室加10%FBS的培养基。
还有一个问题就是matrigel是无菌的吧，用无菌的培养基稀释，凝固了水化后直接可以用吧？
初次做Transwell，不敢贸然下手，多谢指导！谢谢！

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matrigel是无菌的，稀释后就直接铺板即可！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:08

正好在此问一个问题：我在做表皮细胞的复层培养，需要气液界面培养方法，不知气液界面培养时，transwell下面的6孔板准确一些需要加多少培养液？2ml？

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我发现Coring的六孔板transwell下腔加1.5ml就能达到滤膜了，2ml当然也可以。

作者: toy 时间: 2012-4-7 13:09

刚转到这个领域，我还真没找到标准答案，2ml过了不知会不会影响气液界面培养的效果（底层的培养液会不会漫过细胞面？）。
如果1.5ml可以还是应该用1.5就够了

作者: redbutterfly 时间: 2012-4-7 13:09

我有个问题，请问下种板时怎么样种的均匀呢？我染了膜后经常看到穿过的细胞呈团状

作者: shenkunjie 时间: 2012-4-7 13:10

QUOTE:

原帖由 redbutterfly 于 2012-4-7 13:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我有个问题，请问下种板时怎么样种的均匀呢？我染了膜后经常看到穿过的细胞呈团状

是不是考虑不是穿过来呈团状，而是种下去的时候就是团状？

作者: xue258 时间: 2012-4-7 13:10

我想做肿瘤细胞的迁移，用corning的24孔板，滤膜8μm里面有12个小室那种。看了园子里挺多帖，大家好像都没说一般每个处理组要几个平行孔，我要比较四到五种细胞的迁移能力，这能在一块板上完成吗？还有，我的细胞是贴壁细胞，理论上穿过膜后应该会贴在滤膜下表面，但也无法完全排除部分细胞掉落在下室的可能，这时该怎么计算迁移率呢？谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:10

的确，如您所说，气液面培养如果漫过细胞面会妨碍氧的摄取和二氧化碳的弥散，影响细胞的赠殖分化，您可以在1.5-2.0ml之间找一个比较理想的量。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:11

我想做肿瘤细胞的迁移，用corning的24孔板，滤膜8μm里面有12个小室那种。看了园子里挺多帖，大家好像都没说一般每个处理组要几个平行孔，我要比较四到五种细胞的迁移能力，这能在一块板上完成吗？还有，我的细胞是贴壁细胞，理论上穿过膜后应该会贴在滤膜下表面，但也无法完全排除部分细胞掉落在下室的可能，这时该怎么计算迁移率呢？谢谢！

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感谢您的问题。
每个处理组都要设复孔的，一般至少三个。
的确，随着时间的延长，会有少部分细胞掉到下腔去，不过Corning的膜都经过处理，有利于细胞贴附的。也有人包被胶原来增加细胞贴附。
另外，如果各组都是用的同样的transwell,而掉的细胞量又比较少，可以视为背景误差，一般不影响趋势。

作者: 兔唇 时间: 2012-4-7 13:11

我想做一个microRNA对肿瘤细胞侵袭能力的影响，我没做过问个很低级的问题哈，是先把细胞种到小杯子上再转染还是先在孔板里转染好后再消化下来种到小杯子上？我的感觉是种上后再转染。但我不知道转染的方案和孔板里一样吗？

作者: yychen 时间: 2012-4-7 13:12

我还想问一个问题：用24孔板做Transwell（8μm孔径）侵袭实验的话下室应该加好多培养基比较合适呢？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:13

我想做一个microRNA对肿瘤细胞侵袭能力的影响，我没做过问个很低级的问题哈，是先把细胞种到小杯子上再转染还是先在孔板里转染好后再消化下来种到小杯子上？我的感觉是种上后再转染。但我不知道转染的方案和孔板里一样吗？

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感谢您的问题。
个人感觉是不是应该先转染，再评价转染效率，之后才能开展后继实验？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:13

我还想问一个问题：用24孔板做Transwell（8μm孔径）侵袭实验的话下室应该加好多培养基比较合适呢？

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您好，Corning推荐24孔的transwell下腔加0.6ml，上腔0.1ml。

作者: one 时间: 2012-4-7 13:14

你好，我想请教，最近看了篇文献讲应用transwell侵袭实验筛选出转移能力强的肿瘤细胞，通过十轮的transwell侵袭实验，最终从原始肿瘤细胞系筛选出高转移能力的亚系。请问，如何在transwell侵袭实验后收集细胞继续培养而不污染？

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感谢您的问题。
这篇文献很有意思，您方便贴出来看看嘛？
收集细胞可以用胰酶消化，无菌操作即可。

好的，是最近出的PLoS Genet. 2010 Mar 12;6(3):e1000879
全文可直接下载 cuturl('http://www.plosgenetics.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pgen.1000879')
和大家共同学习探讨！

作者: langlang 时间: 2012-4-7 13:15

楼主你好,我现在正在做transwell，用的是24孔的那种。有两个问题。
1，发现24孔板有个普遍的现象就是内皮细胞好在孔的中间聚集成团，不知道您有没有什么好办法可以解决一下这个问题。
2，我做迁移实验，在用药6小时后，用PBS洗涤细胞，但是细胞貌似全被洗没了。不知道是否是未预热的PBS（4度）造成了细胞的脱黏附？
谢谢您的解答，也愿意与大家一起交流！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:16

楼主你好,我现在正在做transwell，用的是24孔的那种。有两个问题。
1，发现24孔板有个普遍的现象就是内皮细胞好在孔的中间聚集成团，不知道您有没有什么好办法可以解决一下这个问题。
2，我做迁移实验，在用药6小时后，用PBS洗涤细胞，但是细胞貌似全被洗没了。不知道是否是未预热的PBS（4度）造成了细胞的脱黏附？
谢谢您的解答，也愿意与大家一起交流！

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感谢您的问题。
二十四孔板的上腔比较小，确实是细胞容易聚集在中间，可以试着种完了细胞轻轻吹一下。
冷PBS的确容易使细胞收缩，掉下来，但是却不至于完全把细胞洗没了，您可以看看是否是其它的因素如迁移时间过长等导致的这个结果。

作者: yueban-1147 时间: 2012-4-7 13:16

斑竹您好：开展这个栏目让我们做transwell小室实验的初学者受益匪浅，谢谢！请教：我做miRNA对癌细胞侵袭能力的影响，我是在小室上室种好细胞，过几个小时再将miRN***段及脂质体形成的转染混合液加入上室细胞悬液，还是在12孔板里转染后24h消化细胞，计数后再种小室？前者操作，下室含胎牛血清的培养液会不会渗透到上室，稀释转染混合液？后者操作，会不会干扰因素太多？
再请教：铺好基质胶稀释液（Matrigel：RPMI 1640=1:4）,成胶后，种上细胞，24-48h仍然很多悬浮细胞，而且数个聚集成球状？为什么很难贴壁？平时消化后种板很容易贴壁的！
致谢！

作者: vcve 时间: 2012-4-7 13:17

楼主你好，最近打算做干细胞与体细胞共培养研究干细胞分化
据我说知，Transwell可以做分层培养，细胞直接不直接接触，但是所分泌的细胞因子可以自由交换，这样属于indirect cell to cell contact，有文献报道indirect cell to cell contact不能诱导干细胞向体细胞分化，请问用Transwell（或者是你们公司其他什么产品）可以做direct cell to cell contact吗？

作者: cj_mondy 时间: 2012-4-7 13:17

请问做药物转运的时候Transwell需要基质胶包被吗？实验的目的是使细胞在滤膜上形成致密单层，然后考察药物从顶层到底层或者反方向的转运量。根据文献有用人胎盘胶原、鼠尾胶原等包被的。，也有没有提到需要包被的，所以很疑惑。目前板子已经买了，但是暂时还没用，并且还有一个问题是这个板子成本高，实验使用次数有限，所以对于怎样提高成功率不知您是否有些建议？谢谢

作者: 831226 时间: 2012-4-7 13:17

请问做药物转运的时候Transwell需要基质胶包被吗？实验的目的是使细胞在滤膜上形成致密单层，然后考察药物从顶层到底层或者反方向的转运量。根据文献有用人胎盘胶原、鼠尾胶原等包被的。，也有没有提到需要包被的，所以很疑惑。目前板子已经买了，但是暂时还没用，并且还有一个问题是这个板子成本高，实验使用次数有限，所以对于怎样提高成功率不知您是否有些建议？谢谢

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你拿其中一块板作练习,用完了把细胞消化下来,多洗两次,再拿酒精泡一泡,紫外灯下照一照,又是一块新的板!哈哈!够你练手用了

作者: 831226 时间: 2012-4-7 13:18

感谢您的问题。
二十四孔板的上腔比较小，确实是细胞容易聚集在中间，可以试着种完了细胞轻轻吹一下。
冷PBS的确容易使细胞收缩，掉下来，但是却不至于完全把细胞洗没了，您可以看看是否是其它的因素如迁移时间过长等导致的这个结果。

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您觉得迁移时间过长会导致细胞脱落,这个我不太赞同,因为更长的时间只能是细胞黏附更加紧密,不知道您有何高见?

作者: newway 时间: 2012-4-7 13:18

计数5-8个视野，肯定不能绝对定量下层细胞准确数，所以在求迁移率的时候，那个公式迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%；中的下层细胞不知怎么算

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-7 13:19

斑竹您好：开展这个栏目让我们做transwell小室实验的初学者受益匪浅，谢谢！请教：我做miRNA对癌细胞侵袭能力的影响，我是在小室上室种好细胞，过几个小时再将miRN***段及脂质体形成的转染混合液加入上室细胞悬液，还是在12孔板里转染后24h消化细胞，计数后再种小室？前者操作，下室含胎牛血清的培养液会不会渗透到上室，稀释转染混合液？后者操作，会不会干扰因素太多？
再请教：铺好基质胶稀释液（Matrigel：RPMI 1640=1:4）,成胶后，种上细胞，24-48h仍然很多悬浮细胞，而且数个聚集成球状？为什么很难贴壁？平时消化后种板很容易贴壁的！
致谢！

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个人认为应该转染后消化再做transwell，我做过miRNA悬浮转染和种板后转染，感觉不好控制消化后的细胞状态，如果消化把握不好，首先转染效果就更不好了，何谈侵袭呢？

作者: any333 时间: 2012-4-7 13:19

不知你做的是什么细胞系？我做的是SW480，之前几次都是转染后24h消化，严格计数，再种小室，但是问题是转染后24h，细胞也增殖了（其中有未转染上的细胞），用于侵袭的细胞不再是最初转染的细胞，这样能反映miRNA对细胞侵袭能力的影响吗？
我用的是公司合成的miRN***段，瞬时转染，起作用的时间应该是48h内，转染后再种小室，等待侵袭过程（应该要48h）， miRN***段的作用还能显现吗？请给予建议，谢谢！

作者: vcve 时间: 2012-4-7 13:20

你拿其中一块板作练习,用完了把细胞消化下来,多洗两次,再拿酒精泡一泡,紫外灯下照一照,又是一块新的板!哈哈!够你练手用了

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真的吗？这样也可以啊，那我就不用发愁了哈，多谢多谢！

作者: bananapeople 时间: 2012-4-7 13:20

版主您好：请问一下transwell和2D-matrigel growth assay，3D-matrigel growth assay有哪些区别？3个实验都适用于哪些研究？谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:21

楼主你好，最近打算做干细胞与体细胞共培养研究干细胞分化
据我说知，Transwell可以做分层培养，细胞直接不直接接触，但是所分泌的细胞因子可以自由交换，这样属于indirect cell to cell contact，有文献报道indirect cell to cell contact不能诱导干细胞向体细胞分化，请问用Transwell（或者是你们公司其他什么产品）可以做direct cell to cell contact吗？

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transwell可以部分“direct cell to cell contact”，先把一种细胞种在transwell膜的下腔面，待其贴壁后，再在上腔面种上另外一种细胞。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:21

您觉得迁移时间过长会导致细胞脱落,这个我不太赞同,因为更长的时间只能是细胞黏附更加紧密,不知道您有何高见?

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哈哈，我说的是穿过了滤膜达到下腔面的细胞有可能因为时间长而进入下腔。见仁见智吧。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:29

计数5-8个视野，肯定不能绝对定量下层细胞准确数，所以在求迁移率的时候，那个公式迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%；中的下层细胞不知怎么算

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对于悬浮细胞，可以采用迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%；

可是对于贴壁细胞情况就不太一样了。的确，对于穿过了滤膜到达下腔面的细胞取几个视野进行计数只是一种相对计数。
如果是追求绝对计数，那恐怕只有把上腔面的细胞擦掉，再把滤膜中的细胞消化出来了，不知道有没有群友在文献中看到这种方法？

作者: cocacola 时间: 2012-4-7 13:31

我想做趋化因子对肿瘤的趋化作用，请问如果transwell上下室的培养基成分不同，会不会通过中间的膜相互渗透，下室的趋化因子会不会进入上室。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-7 13:32

不知你做的是什么细胞系？我做的是SW480，之前几次都是转染后24h消化，严格计数，再种小室，但是问题是转染后24h，细胞也增殖了（其中有未转染上的细胞），用于侵袭的细胞不再是最初转染的细胞，这样能反映miRNA对细胞侵袭能力的影响吗？
我用的是公司合成的miRN***段，瞬时转染，起作用的时间应该是48h内，转染后再种小室，等待侵袭过程（应该要48h）， miRN***段的作用还能显现吗？请给予建议，谢谢！

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如果你用带荧光的miRNA，一般转染后6小时就可以检测到细胞内有大量的荧光。考虑到靶蛋白有半衰期，48小时检测应该是没错的，文献中大部分也是转染后48小时和72小时检测侵袭和凋亡等生物学行为的改变的。因为miRNA mimic的对照细胞也同时在增值，所以检测的作用当然能显现。你做的结果如何呢？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-7 13:32

今天用matrigel铺胶，讲下心得。1比4稀释后，每孔加33微升，因为胶比较少，打下去在膜上形成一滴，没铺满膜，所以想用枪吸了铺匀，但是容易起泡泡，所以加了不能用枪再吸，应该把板摇晃铺匀。

作者: 二丫头466 时间: 2012-4-7 13:33

不同品牌的matrigel浓度不一样，楼上可否提供是哪里来源的matrigel？谢谢分享！

作者: 二丫头466 时间: 2012-4-7 13:33

我想做趋化因子对肿瘤的趋化作用，请问如果transwell上下室的培养基成分不同，会不会通过中间的膜相互渗透，下室的趋化因子会不会进入上室。

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会的，所以迁移时间一般在24h内

作者: wu11998866 时间: 2012-4-7 13:33

不同品牌的matrigel浓度不一样，hzbchc战友可否提供是哪里来源的matrigel？谢谢分享！

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BD的matrigel,货号356234（Basement Membrane Matrix）。铺胶后放到细胞培养箱了，明天去看成胶了没有。

作者: mamamiya 时间: 2012-4-7 13:34

再次请问版主做血脑屏障模型时有个4小室试漏实验，即通过小室内外两侧的液平面有无差别来判断模型是否初步建成！请问观察液面有无差别时是通过什么方法观察？使用肉眼观察吗？有无更科学的方法？
感谢指导!

作者: TNT 时间: 2012-4-7 13:35

做了，结果不怎么理想，对照组穿透的细胞数不够多，实验组更少了，考虑可能是自己铺胶偏厚（之前参考文献一般是铺50-80微升），另外，细胞还应该适当多种（3-5*104）。
另外，也小提一点点自己的铺胶心得吧。最好铺胶前一晚把matrigel置于4度，充分液化；铺胶时，枪头与EP管最好已经冰箱预冷10分钟以上，稀释胶的过程都在冰上操作，速度快，避免未稀释好，因为室温高已经部分成胶。一般铺胶后放到细胞培养箱4h,已经成胶。

作者: bongte 时间: 2012-4-7 13:35

我想在insert里接种混有成纤维细胞的胶原，希望形成凝胶构成三维培养，关于不同coating和孔直径的选择，楼主有什么好的建议吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:35

我想在insert里接种混有成纤维细胞的胶原，希望形成凝胶构成三维培养，关于不同coating和孔直径的选择，楼主有什么好的建议吗？（btw，东方朔，经常看到你活跃在丁香园，算是陌生的老朋友了）

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欢迎陌生的老朋友来一起交流。个人看法：如果只是考察下腔因素对上腔内成纤维细胞的三维生长的作用，孔径选择0.4微米。如何包被好像不是太重要。

欢迎讨论。

作者: cocacola 时间: 2012-4-7 13:36

再请教一个问题,我用的是HUVEC,看细胞迁移的.不过无论是给药组还是control组，细胞都穿不过膜（聚碳酯膜，8um，货号3422）。作用6小时，预覆盖的明胶（或胶原），细胞总是在膜的上层。请教一下如何才能使细胞跨过膜？
多谢！

作者: viviwang1987 时间: 2012-4-7 13:36

我们买的没有铺胶的transwell小室，请问要稀释基质胶的话，基质胶和DMEM的比例是多少啊？也就是说稀释后的基质胶的浓度是多少？谢谢解答！

作者: viviwang1987 时间: 2012-4-7 13:37

请问版主，我们要做HUVEC的transwell迁移实验，需要铺基质胶吗？

作者: BUK 时间: 2012-4-7 13:37

请问版主，我们要做HUVEC的transwell迁移实验，需要铺基质胶吗？

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需要的,我用的是5%明胶,也可以用胶原,大概在2%这个样子吧,sigma有现成的。当然,你也可以用matrigel，具体浓度参照其说明书。

作者: loli 时间: 2012-4-7 13:38

请问做肿瘤细胞侵袭实验如何选择transwell的孔径？是不是要根据细胞的直径大小？孔径要比细胞直径大多少合适？为了保险，是不是可以选最大的孔径？网上怎么查找某个细胞的直径？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:38

再请教一个问题,我用的是HUVEC,看细胞迁移的.不过无论是给药组还是control组，细胞都穿不过膜（聚碳酯膜，8um，货号3422）。作用6小时，预覆盖的明胶（或胶原），细胞总是在膜的上层。请教一下如何才能使细胞跨过膜？
多谢！

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感谢您的问题。我可不是什么大师，只是想和群友们交流使用transwell的使用经验，互相学习共同进步。
个人感觉可以从以下几方面找找原因：迁移的时间是否足够？预先铺明胶是否必要？是否影响了迁移？种入上腔的细胞活力如何？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:38

请问版主，我们要做HUVEC的transwell迁移实验，需要铺基质胶吗？

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个人观点也可以尝试不铺胶。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:39

请问做肿瘤细胞侵袭实验如何选择transwell的孔径？是不是要根据细胞的直径大小？孔径要比细胞直径大多少合适？为了保险，是不是可以选最大的孔径？网上怎么查找某个细胞的直径？

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可以看看您那种肿瘤细胞的相关参考文献选用大都是多少。贴壁细胞一般选用8微米，悬浮细胞一般选用5微米。

作者: kuaizige 时间: 2012-4-7 13:39

你好
我做的是HUVEC的趋化，我参考的文献中，他是在下室放细胞，最后测膜上的细胞数目。这与我们常规在上室加细胞，在膜下测细胞数目会有不同吗？

作者: c86v 时间: 2012-4-7 13:40

想问一下，为什么迁移实验要在下层加一定比例的FBS呢？我想做VEGF诱导HUVECs的迁移，但是自己当时参考了一下BD和Corning的说明书，没有看到说是下面要加FBS，然后在园子里看别人说做侵袭实验的时候，要在下面一层加FBS。我当时以为是FBS加入在下面就可以诱导细胞穿过膜，而我使用的不过是另外一个诱导剂VEGF，所以我就没有加FBS，直接把上下两层液体都用的一样的，只是下层加了VEGF，其他成分都一样。但是这次做了实验之后发现，细胞迁移得非常少，当问了一位同事之后才知道要在下层加入FBS，不然细胞会迁移得很少很慢的。我不明白是为什么，既然要考察VEGF诱导HUVECs迁移的情况，为什么要加入FBS再去诱导细胞迁移，这样即使迁移得多，到底是VEGF的作用还是FBS的作用呢？

作者: qumm1985 时间: 2012-4-7 13:40

想问一下，为什么迁移实验要在下层加一定比例的FBS呢？我想做VEGF诱导HUVECs的迁移，但是自己当时参考了一下BD和Corning的说明书，没有看到说是下面要加FBS，然后在园子里看别人说做侵袭实验的时候，要在下面一层加FBS。我当时以为是FBS加入在下面就可以诱导细胞穿过膜，而我使用的不过是另外一个诱导剂VEGF，所以我就没有加FBS，直接把上下两层液体都用的一样的，只是下层加了VEGF，其他成分都一样。但是这次做了实验之后发现，细胞迁移得非常少，当问了一位同事之后才知道要在下层加入FBS，不然细胞会迁移得很少很慢的。我不明白是为什么，既然要考察VEGF诱导HUVECs迁移的情况，为什么要加入FBS再去诱导细胞迁移，这样即使迁移得多，到底是VEGF的作用还是FBS的作用呢？

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要是做趋化因子的话，是不需要加FBS的。

作者: c86v 时间: 2012-4-7 13:41

请问细胞趋化和细胞迁移实验有什么区别吗？我也不知道怎么回答楼上的问题，我做的是VEGF诱导HUVECs细胞的迁移实验。但是，我看见园子里面总结transwell的时候是把趋化，迁移，侵袭实验分别总结的，侵袭实验比起迁移实验多加了一层基质胶，但是不知道趋化实验和迁移实验有什么分别。如果没有分别的话，那么我想我也可以回答楼上说我做的也算是细胞趋化实验。但是，不加FBS效果就是没有什么细胞迁移，不知道为什么？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:41

你好
我做的是HUVEC的趋化，我参考的文献中，他是在下室放细胞，最后测膜上的细胞数目。这与我们常规在上室加细胞，在膜下测细胞数目会有不同吗？

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您好。拜读了您提供的文献之后发现，该文献在介绍transwell方法时，引用的是更早的一篇发表于PNAS上的文献，而这篇PNAS则引用了一篇发表于1989年Cell上的文献，目前sciencedirect上面没有这篇cell的全文。
从您提供的clinical cancer research的文献和我找到的PNAS的文献上，我都没有发现作者对倒置使用的解释。
期待有做过的高手来解答！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:42

谢谢楼主！
受益匪浅。也想做这方面的实验，但不知成本如何？

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您客气了。corning的transwell板每块一到两百元左右，有些实验可以重复使用。你可以根据自己的实验设计算算大概的开销。
欢迎多交流。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 13:42

你好版主我打算做肿瘤细胞的侵袭试验，我想问一下下室加什么趋化因子呢？上室一般是无血清的培养液，下室加多高浓度的血清呢。有的文献报道细胞饥饿24h后在做侵袭，这样有必要吗？期待你的答复，谢谢了

作者: 缘yuan 时间: 2012-4-7 13:43

您客气了。corning的transwell板每块一到两百元左右，有些实验可以重复使用。你可以根据自己的实验设计算算大概的开销。
欢迎多交流。

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请问，哪里可以买到corning的transwell板，能否把代理商的电话号码发给我。谢谢！

作者: jkobn 时间: 2012-4-7 13:43

版主您好！
看了大家的讨论，真的感到收益匪浅，对Transwell有了更多的了解。
我有问题想请教:
（1）我的试验是将两种细胞共培养，一种悬浮细胞，一种是贴壁细胞，我准备选用孔径为0.4微米，PET膜的Transwell小室，将悬浮细胞种于上腔，贴壁细胞种于6孔板上，看悬浮细胞分泌的因子对下层细胞的作用。但是我需要将下层的贴壁细胞传很多代，即两种细胞共培养很多代，请问Transwell小室能重复使用吗？
（2）若想研究两种细胞的接触作用，能否想您先前说的，将贴壁细胞种于膜的反面，膜的上面养悬浮细胞？若研究贴壁细胞的改变，获取贴壁细胞，是否也是用胰酶将其从膜的反面消化下来？此时Transwell小室还能重复使用吗？
期待您的回答，万分感谢！！

作者: zhenxin 时间: 2012-4-7 13:44

你好！感谢你给大家提供了一个Transwell技术咨询、学习、交流的地方！谢谢。我想利用Transwell建立一个两种贴壁细胞的共培养体系。一种是人的正常神经细胞，接种于下室：一种是人的胎盘间充质干细胞（hPMSC），接种于上室，通过神经细胞在生长过程中说释放的因子诱导hPMSC向神经细胞分化，有如下问题：
1.整个过程大约需要7天，那么在中间怎么观察上室中的hPMSC的细胞形态的改变呢？我看有文献说3-4天时细胞有形态的改变，并有照片，不知在常用的倒置显微镜下如何观察？
2.如果诱导成功需要对上室中的hPMSC进行神经细胞免疫组化和荧光检测（β-Tubulin、NSE），那么要把上室拿出来放在一个新的没有细胞的孔板中在加相关试剂吗？膜上的孔洞是否影响照片？如果在上室中加盖玻片意思太小不好放（我是24孔），二是影响因子的上下交流，那么免疫检测应如何做？
3。我用的24孔板，大约需要加多少培养基呢？
刚准备做此实验，叨扰斑竹了，也希望以后能像斑竹一样为同仁们提供帮助！

作者: 缘yuan 时间: 2012-4-7 13:45

再请教个问题：聚酯膜和聚碳酯膜有什么区别，都可以用来做肿瘤细胞的侵袭实验吗？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-4-7 13:45

你好版主我打算做肿瘤细胞的侵袭试验，我想问一下下室加什么趋化因子呢？上室一般是无血清的培养液，下室加多高浓度的血清呢。有的文献报道细胞饥饿24h后在做侵袭，这样有必要吗？期待你的答复，谢谢了

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一般下室加10%的血清，上室0.5%血清。造成一个血清梯度。如果你想做趋化因子，可以上室不加而下室加，造成一个趋化因子梯度。必须血清饥饿一下，效果好。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-4-7 13:45

你好！感谢你给大家提供了一个Transwell技术咨询、学习、交流的地方！谢谢。我想利用Transwell建立一个两种贴壁细胞的共培养体系。一种是人的正常神经细胞，接种于下室：一种是人的胎盘间充质干细胞（hPMSC），接种于上室，通过神经细胞在生长过程中说释放的因子诱导hPMSC向神经细胞分化，有如下问题：
1.整个过程大约需要7天，那么在中间怎么观察上室中的hPMSC的细胞形态的改变呢？我看有文献说3-4天时细胞有形态的改变，并有照片，不知在常用的倒置显微镜下如何观察？
2.如果诱导成功需要对上室中的hPMSC进行神经细胞免疫组化和荧光检测（β-Tubulin、NSE），那么要把上室拿出来放在一个新的没有细胞的孔板中在加相关试剂吗？膜上的孔洞是否影响照片？如果在上室中加盖玻片意思太小不好放（我是24孔），二是影响因子的上下交流，那么免疫检测应如何做？
3。我用的24孔板，大约需要加多少培养基呢？
刚准备做此实验，叨扰斑竹了，也希望以后能像斑竹一样为同仁们提供帮助！

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可否考虑把想要操作的细胞放在下面养？甚至可以放入无菌包被过的盖玻片培养？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:46

版主您好！
看了大家的讨论，真的感到收益匪浅，对Transwell有了更多的了解。
我有问题想请教:
（1）我的试验是将两种细胞共培养，一种悬浮细胞，一种是贴壁细胞，我准备选用孔径为0.4微米，PET膜的Transwell小室，将悬浮细胞种于上腔，贴壁细胞种于6孔板上，看悬浮细胞分泌的因子对下层细胞的作用。但是我需要将下层的贴壁细胞传很多代，即两种细胞共培养很多代，请问Transwell小室能重复使用吗？
（2）若想研究两种细胞的接触作用，能否想您先前说的，将贴壁细胞种于膜的反面，膜的上面养悬浮细胞？若研究贴壁细胞的改变，获取贴壁细胞，是否也是用胰酶将其从膜的反面消化下来？此时Transwell小室还能重复使用吗？
期待您的回答，万分感谢！！

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感谢您的问题。谈一下个人观点：
1、如果是贴壁细胞种在底下的6孔板上，悬浮细胞种在tanswell杯子里面，应该可以使用一段时间。但是，时间太长了，悬浮细胞在培养过程中产生的细胞碎片会不会堵塞膜上的孔？所以，从这个角度来说小室不宜使用时间过长.
2、如果两种细胞都是贴壁生长，可以在膜的反正两面都种，这样部分细胞会透过孔有所接触。但是如果是一方为悬浮细胞，另外一方是贴壁细胞，就很难讲了，毕竟悬浮细胞不会像贴壁细胞那样会有部分结构进入孔中。如果采用胰酶把贴壁细胞消化下来，再重复使用transwell小室，很难保证没有部分孔被细胞碎片和细胞外基质堵塞，所以，保险起见，不推荐这样用。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 13:46

感谢你给大家提供了一个Transwell技术咨询、学习、交流的地方！谢谢。我想利用Transwell建立一个两种贴壁细胞的共培养体系。一种是人的正常神经细胞，接种于下室：一种是人的胎盘间充质干细胞（hPMSC），接种于上室，通过神经细胞在生长过程中说释放的因子诱导hPMSC向神经细胞分化，有如下问题：
1.整个过程大约需要7天，那么在中间怎么观察上室中的hPMSC的细胞形态的改变呢？我看有文献说3-4天时细胞有形态的改变，并有照片，不知在常用的倒置显微镜下如何观察？
2.如果诱导成功需要对上室中的hPMSC进行神经细胞免疫组化和荧光检测（β-Tubulin、NSE），那么要把上室拿出来放在一个新的没有细胞的孔板中在加相关试剂吗？膜上的孔洞是否影响照片？如果在上室中加盖玻片意思太小不好放（我是24孔），二是影响因子的上下交流，那么免疫检测应如何做？
3。我用的24孔板，大约需要加多少培养基呢？
刚准备做此实验，叨扰斑竹了，也希望以后能像斑竹一样为同仁们提供帮助！

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感谢您的问题。群友的办法很好，个人再补充一下。
1、您可以选用透明的PET膜。观察细胞的时候可以调节显微镜的焦距分别观察膜上的和下层的细胞状态。
3、corning 推荐24孔板内用的transwell下腔加液0.6ml,上腔加液0.1ml。

作者: KGZ564 时间: 2012-4-7 13:47

版主：您好！我要做的和楼上差不多，看了您对楼上和其他群友疑问的回答后，仍有不解之处，烦请您解答。
1.您曾答道，可以采用将上腔倒置，细胞悬液滴在膜上，待4-6h后贴壁，即可实现膜双面贴壁细胞，请问这4-6h，怎么放置细胞呢？超净台内？培养箱内？呵呵，想不出该怎么放。
2.我的实验需要同时做上下腔细胞的MTT，如果膜双面贴壁细胞培养，该如何进行两种贴壁细胞的MTT呢？是否需要消化后转移至普通细胞板？如果不是接触共培养，只是接种在上下腔的两种细胞，MTT方法和接触培养的是否一致呢？
3.24孔板的上腔，悬浮细胞的一般合适浓度是多少？贴壁细胞呢？
4.此外，想请问您有无做过肿瘤细胞和免疫细胞相互作用的类似实验？是否知道Transwell实验中免疫细胞和肿瘤细胞的合适效靶比是多少？
5.您上面说板的价格是100-200元，是人民币吗？我买的怎么是700元一块啊？您能否也告知我您的购买渠道啊？
谢谢版主的耐心解答！！

作者: dragonkilly 时间: 2012-4-7 13:48

可否考虑把想要操作的细胞放在下面养？甚至可以放入无菌包被过的盖玻片培养？

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首先谢谢斑竹支持！我开始想过把我要观察的细胞养在下室中，但问题是我看文献一般都养在上室，而且我要用的人正常神经细胞不能增殖所以不能传代，如果要直接养在上室中着实困难。至于盖玻片，我看过别人的24孔板的上室，实在是小的可以，不好弄，不好弄，现在正养着神经细胞还不知道能不能养出来，郁闷郁闷。

作者: dragonkilly 时间: 2012-4-7 13:48

感谢您的问题。群友的办法很好，个人再补充一下。
1、您可以选用透明的PET膜。观察细胞的时候可以调节显微镜的焦距分别观察膜上的和下层的细胞状态。
3、corning 推荐24孔板内用的transwell下腔加液0.6ml,上腔加液0.1ml。

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1.关于PET膜，我查了一下园子，是不是就是放在上室中的孔膜呀，不同的Transwell是不是有不同性质的膜，而斑竹给推荐的透明的就可以通过调节显微镜而观察到上室的细胞情况了，是这样的理解吗？我现在还不知道我的24孔板的膜是什么样子的？是哪个公司的？惭愧！以后买Corning的，比我的也便宜呀！！
2.如果我的Transwell里的不是PET透明膜，该如何？换Transwell？换膜？
3继续追问一下问题，上室细胞的染色，膜的孔洞会不会影响染色效果。
4.我的是两种细胞，对您所说的膜正方两面的种植细胞的方法很感兴趣，继续关注中。。。。
谢谢斑竹精彩回答，大恩不言谢，只有把斑竹的帮助继续下去，将来帮助别人。.

作者: ladyhuahua 时间: 2012-4-7 13:59

细胞趋化试验对通透膜下腔面的细胞进行染色采用普通的HE染色就可以吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:00

版主：您好！我要做的和楼上差不多，看了您对楼上和其他群友疑问的回答后，仍有不解之处，烦请您解答。
1.您曾答道，可以采用将上腔倒置，细胞悬液滴在膜上，待4-6h后贴壁，即可实现膜双面贴壁细胞，请问这4-6h，怎么放置细胞呢？超净台内？培养箱内？呵呵，想不出该怎么放。
2.我的实验需要同时做上下腔细胞的MTT，如果膜双面贴壁细胞培养，该如何进行两种贴壁细胞的MTT呢？是否需要消化后转移至普通细胞板？如果不是接触共培养，只是接种在上下腔的两种细胞，MTT方法和接触培养的是否一致呢？
3.24孔板的上腔，悬浮细胞的一般合适浓度是多少？贴壁细胞呢？
4.此外，想请问您有无做过肿瘤细胞和免疫细胞相互作用的类似实验？是否知道Transwell实验中免疫细胞和肿瘤细胞的合适效靶比是多少？
5.您上面说板的价格是100-200元，是人民币吗？我买的怎么是700元一块啊？您能否也告知我您的购买渠道啊？
谢谢版主的耐心解答！！

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1、我是这样做的：把traswell倒置后，然后把细胞调成单细胞悬液（浓度要大一些，液体总量少一些）滴在transwell膜的下腔面，尽量涂匀，然后翻转，放到培养板内，然后再放到培养箱内。细胞因为张力的原因不会掉下来，逐渐会贴到膜上。如果担心培养基干了，可以过一段时间往膜上加一点培养基。4-6小时后，细胞肯定已经贴牢固了，然后再往下腔加入培养基，上腔再种入另外一种细胞。
2、这取决于您的实验目的。您必须用MTT看两种细胞共培养的变化吗？相关文献怎样做的？
3、上腔种多少细胞要看您培养时间的长短，细胞的种类等等，不好一概而论的。
4、同上面一个问题，要具体问题具体分析的。
5、抱歉，如果有这么大的差别，建议您和Corning公司联系，因为我们实验室有专人负责订货，可能我说的不够准确，真抱歉，我把Corning的联系方式PM您吧。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:00

感谢您的回答，真的好及时，您也还是在做着实验的呀，难得难得。
1.关于PET膜，我查了一下园子，是不是就是放在上室中的孔膜呀，不同的Transwell是不是有不同性质的膜，而斑竹给推荐的透明的就可以通过调节显微镜而观察到上室的细胞情况了，是这样的理解吗？我现在还不知道我的24孔板的膜是什么样子的？是哪个公司的？惭愧！以后买Corning的，比我的也便宜呀！！
2.如果我的Transwell里的不是PET透明膜，该如何？换Transwell？换膜？
3继续追问一下问题，上室细胞的染色，膜的孔洞会不会影响染色效果。
4.我的是两种细胞，对您所说的膜正方两面的种植细胞的方法很感兴趣，继续关注中。。。。
谢谢斑竹精彩回答，大恩不言谢，只有把斑竹的帮助继续下去，将来帮助别人。.

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感谢您的问题。
1和2、您可以先看看自己在用的transwell是哪个公司的，确定货号，然后上网看说明书，一切就都明白啦。
3、如果是直接在transwell的膜上做个结晶紫之类的染色，然后收个照片，孔洞不会影响效果的，如果是做免疫荧光，个人就不知道了，您可以查查文献，或者做个预实验吧。
4、正反两面种细胞的方法是个人从师姐那里学来的，觉得效果不错。如果您在试验中有心得欢迎和大家一起分享。丁香园是大家交流学习的好平台，真的是人人为我，我为人人。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:04

细胞趋化试验对通透膜下腔面的细胞进行染色采用普通的HE染色就可以吗？

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其实各种染色方法都有报道的，只有您觉得收的照片好看，能发表用就可以了。

作者: 101010 时间: 2012-4-7 14:04

谢谢您，我想可能是由于我买的是24孔的HTS-Transwell，所以比较贵吧！我再查查看！

作者: 66+77 时间: 2012-4-7 14:05

流式细胞仪分选：可以用两种染料，测定三种参数分选吗？
想用Hoechst 33342和罗丹明123（或TMRM）两种染料染色，可以通过FCM分选吗？
罗丹明用来分选线粒体膜电位（分选线粒体膜电位较高的5%），Hoechst 33342用来分选SP细胞，可以一次染色完成这两件事吗？即分选出膜电位较高5%的SP细胞？
从没做过实验，第一次设计方案，看了不少资料，还是不明白。请不吝赐教，非常感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:05

流式细胞仪分选：可以用两种染料，测定三种参数分选吗？
想用Hoechst 33342和罗丹明123（或TMRM）两种染料染色，可以通过FCM分选吗？
罗丹明用来分选线粒体膜电位（分选线粒体膜电位较高的5%），Hoechst 33342用来分选SP细胞，可以一次染色完成这两件事吗？即分选出膜电位较高5%的SP细胞？
从没做过实验，第一次设计方案，看了不少资料，还是不明白。请不吝赐教，非常感谢！

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呵呵，细胞版的版主好像有一位就是流式的专业老师。
关于FACS做sorting，您可以在版内搜一下记得相关的问题有不少精华帖呢，最近的一个是这个cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=15566071&sty=1&tpg=1&age=0')。

作者: ha111 时间: 2012-4-7 14:05

最近需购买一批corning的transwell细胞培养板，请楼主提供一下corning公司的联系方式？还有，做成骨细胞迁移实验不需要铺胶？谢谢！

作者: 大尾巴 时间: 2012-4-7 14:06

谢谢楼主的无私奉献。

想请教一下楼主，我现在在做肿瘤细胞的侵袭实验，买了BD公司的Matrigel，用的时候用无血清1640稀释了5倍，然后往24孔的transwell小室里加50微升，2个小时以后发现胶都没凝上，4个多小时后还是凝的不充分，这是为什么呢？是我稀释的太稀了嘛？

还有我看其他群友的protocol说，等胶凝后，用1640洗一遍胶，这一步是必须的嘛？我洗了之后用枪把液体吸出来的时候常常就把胶破坏掉。

恳请楼主的解惑，谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:06

近需购买一批corning的transwell细胞培养板，请楼主提供一下corning公司的联系方式？还有，做成骨细胞迁移实验不需要铺胶？谢谢！

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您好。Coring公司的联系方式已经PM您。个人看法；成骨细胞做迁移可以不铺胶。另外您可以查查文献，看看自己所用的细胞一般用哪种方案，以作参考。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:07

谢谢楼主的无私奉献。

想请教一下楼主，我现在在做肿瘤细胞的侵袭实验，买了BD公司的Matrigel，用的时候用无血清1640稀释了5倍，然后往24孔的transwell小室里加50微升，2个小时以后发现胶都没凝上，4个多小时后还是凝的不充分，这是为什么呢？是我稀释的太稀了嘛？

还有我看其他群友的protocol说，等胶凝后，用1640洗一遍胶，这一步是必须的嘛？我洗了之后用枪把液体吸出来的时候常常就把胶破坏掉。

恳请楼主的解惑，谢谢！

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您铺胶之后放到37度培养箱了吗？按说，这么长时间应该凝固了。可以试着接触下BD的技术支持。也可以试着少加点，40微升试试。

您洗后吸出培养基的时候，操作可以慢一些，如果胶凝好了，一般不会破坏的。

作者: is2011 时间: 2012-4-7 14:11

最近需购买一批corning的transwell细胞培养板，请楼主也给我提供一下corning公司的联系方式好吗？谢谢

作者: pengke1983 时间: 2012-4-7 14:11

你好~一直对transwell涂胶原这个部分不太明白，请问下涂胶原的具体操作，能告诉一下protocol吗？麻烦了，实在感谢

作者: yychen 时间: 2012-4-7 14:12

版主你好，最近做过几次Transwell，现在有个问题还需要向你请教一下：甲醛固定之前怎么才能确定上室内的细胞全部被擦掉？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:12

你好~一直对transwell涂胶原这个部分不太明白，请问下涂胶原的具体操作，能告诉一下protocol吗？麻烦了，实在感谢

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您好。这个实在没有固定的protocol,见仁见智吧，最好参考和自己做的比较相似的文献。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-7 14:12

版主你好，最近做过几次Transwell，现在有个问题还需要向你请教一下：甲醛固定之前怎么才能确定上室内的细胞全部被擦掉？

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其实上室的细胞是能肉眼看见的，基本上，用棉棒一擦，就可以明显看到像把脏玻璃上一层灰抹掉的样子。擦两三遍就行，不过最好不要把膜捅破就行。

作者: qhyu 时间: 2012-4-7 14:13

马上要做实验了，我想了解一下transwell技术和millicell技术有什么不同之处或者是优于millicell的方面？

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:13

刚刚接触到Transwell，想请教一下：1.上室培养液要用无血清的吗？我做的是细胞共培养，上室不加血清细胞可以成活吗？2.镜下看的时候，通过调焦，看到膜的层面黑乎乎的，看不清细胞，是怎么回事呢？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:14

马上要做实验了，我想了解一下transwell技术和millicell技术有什么不同之处或者是优于millicell的方面？

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结构都差不多：一个小杯子带一有孔的通透膜。
Corning管自己的产品叫transwell,millipore把自己的产品叫millicell.

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:14

刚刚接触到Transwell，想请教一下：1.上室培养液要用无血清的吗？我做的是细胞共培养，上室不加血清细胞可以成活吗？2.镜下看的时候，通过调焦，看到膜的层面黑乎乎的，看不清细胞，是怎么回事呢？

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客气了。
1、较长时间的细胞共培养，无论上腔还是下腔都要用含血清培养基;
2、如果您选用的是透明的膜，应该是可以看见的。

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:15

刚刚接触到Transwell，想请教一下：1.上室培养液要用无血清的吗？我做的是细胞共培养，上室不加血清细胞可以成活吗？2.镜下看的时候，通过调焦，看到膜的层面黑乎乎的，看不清细胞，是怎么回事呢？

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客气了。
1、较长时间的细胞共培养，无论上腔还是下腔都要用含血清培养基;
2、如果您选用的是透明的膜，应该是可以看见的。

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多谢指导！透过膜可以看到下室细胞的，现在问题是我找不到膜层面（上室）的细胞（贴壁细胞），现上传两张图片，看一下这是膜吗？谢谢~~

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:15

这个视野是膜层面吗

图片附件: 20785557.snap.jpg (2012-4-7 14:15, 77.78 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11535

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:15

还有一张图片

图片附件: 77763863.snap.jpg (2012-4-7 14:15, 58.36 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11536

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:16

刚刚接触到Transwell，想请教一下：1.上室培养液要用无血清的吗？我做的是细胞共培养，上室不加血清细胞可以成活吗？2.镜下看的时候，通过调焦，看到膜的层面黑乎乎的，看不清细胞，是怎么回事呢？

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客气了。
1、较长时间的细胞共培养，无论上腔还是下腔都要用含血清培养基;
2、如果您选用的是透明的膜，应该是可以看见的。

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多谢指导！透过膜可以看到下室细胞的，现在问题是我找不到膜层面（上室）的细胞（贴壁细胞），现上传两张图片，看一下这是膜吗？谢谢~~

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我的图片供您参考：

图片附件: 99148830.snap.jpg (2012-4-7 14:16, 47.77 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11537

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:16

更高一些的放大倍数：

图片附件: 24624995.snap.jpg (2012-4-7 14:16, 36.72 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11538

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:17

多谢指教O(∩_∩)O~上图的细胞是不是铺上后还未贴壁的状态啊~这是多大孔径的膜呢？

作者: wmp1234 时间: 2012-4-7 14:17

用transwell做内皮细胞通透性，如何检测渗入下室荧光染料的量，要将上室细胞和荧光染料洗干净吗？怎么洗？

作者: one 时间: 2012-4-7 14:17

我又来请教LZ了。

BD的胶，1640 1:3稀释，24孔板小室，每室50微升，37度培养箱凝4个小时后，加细胞悬液300微升（内含100 000个细胞），下室为含20%胎牛的培养液。

昨天晚上加的细胞，今天看的时候细胞聚集成团，都死了。

上面的条件是我前天刚摸索出来的，36小时有穿过去，48小时穿过更多。

为什么再次重复实验细胞就死了，和前次一样的操作。

我前几天摸的胶的稀释浓度梯度，1:1,1:4两个梯度，细胞也都是死的。

请LZ帮我分析一下，到底是怎么回事，是我哪里操作不对吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:18

多谢指教O(∩_∩)O~上图的细胞是不是铺上后还未贴壁的状态啊~这是多大孔径的膜呢？

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指教不敢当，互相学习吧。的确，上面的照片是细胞还没有贴壁的时候拍的，膜的孔径是0.4微米。再把贴壁的状态发出来。

图片附件: 36458901.snap.jpg (2012-4-7 14:18, 31.29 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11539

作者: guagua 时间: 2012-4-7 14:18

楼主这个图好清晰啊~我的就是找不好膜的层面~在仔细找找看看，hoho

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:19

我又来请教LZ了。

BD的胶，1640 1:3稀释，24孔板小室，每室50微升，37度培养箱凝4个小时后，加细胞悬液300微升（内含100 000个细胞），下室为含20%胎牛的培养液。

昨天晚上加的细胞，今天看的时候细胞聚集成团，都死了。

上面的条件是我前天刚摸索出来的，36小时有穿过去，48小时穿过更多。

为什么再次重复实验细胞就死了，和前次一样的操作。

我前几天摸的胶的稀释浓度梯度，1:1,1:4两个梯度，细胞也都是死的。

请LZ帮我分析一下，到底是怎么回事，是我哪里操作不对吗？

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和您一起分析一下，互相学习，也欢迎有经验的站友来一起讨论。
1、稀释的浓度，以前听说过有人用DMEM或者1640稀释达到1:8的，胶太稠，细胞是不是也不容易过去？
2、上室种多少细胞，您上室种了10的6次方，300微升重悬，细胞多不多？
3、既然有时候能成功，说明离合适的条件不远了，您要有信心。

作者: daod 时间: 2012-4-7 14:19

您好！我想问一下，我想利用转染后细胞做Transwell实验研究基因对细胞侵袭的影响。Corning 24孔小室应该加多少微升的基质胶？基质胶不太容易涂匀，您有什么好办法可以解决此问题？基质胶浓度为多少最为合适？转染后的细胞是瞬时转染还是稳定转染更适合于此研究？一般接种浓度和细胞悬液体积应该为多少？刚刚接触这个实验，做了几次结果都不理想，所以问题多了些，请大使见谅！盼望着您的回复！谢谢！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-4-7 14:20

如果你的基因比较靠下游，就是说直接与侵袭相关，我想可以做瞬时，但是如果基因比较靠上游，而且做稳定表达不难的话，还是稳定的吧。

作者: one 时间: 2012-4-7 14:20

和您一起分析一下，互相学习，也欢迎有经验的站友来一起讨论。
1、稀释的浓度，以前听说过有人用DMEM或者1640稀释达到1:8的，胶太稠，细胞是不是也不容易过去？
2、上室种多少细胞，您上室种了10的6次方，300微升重悬，细胞多不多？
3、既然有时候能成功，说明离合适的条件不远了，您要有信心。

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多谢指点！
我上室种的是10的5次方个细胞，300微升重悬，细胞数目应该不是很多。

作者: greenbee 时间: 2012-4-7 14:20

您客气了。corning的transwell板每块一到两百元左右，有些实验可以重复使用。你可以根据自己的实验设计算算大概的开销。
欢迎多交流。

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我也在做Transwell，师兄留下来的板都被我预实验用完了，东方大使可以把Corning的购买联系方式告诉我吗？

另外再问个小问题，但是也是决定实验的重要因素，就是种板100ul的细胞悬液后，细胞都聚集在胶的中心部位，周围都没什么细胞，所以染色后，在小室的下腔也是在中间有细胞，这样得到的结果肯定也是不可靠的，不知有什么办法在种板的时候让细胞均匀呢？谢谢东方大使！

作者: 8s5g 时间: 2012-4-7 14:21

太感谢高手了，刚看到这个帖子，后悔晚矣

前几天我尝试做了transwell,但是遇到几个问题，已经看了前面的帖子，仍有不明白的地方，还望版主及东方朔帮助解答：
1.我开始是看说明书上，24孔板，8um,胶按照1：2稀释的，加了50ul.胶是不是太厚了
2.过夜后在膜层面上没有看到细胞，过了48小时发现在膜的那层“有一些圆形小珠”的这个层面上可以看到细胞的影子，但好像还是在上室，只是向下侵袭了一部分而已。问一下该如何更准确的判断到底是不是已经穿过膜?
3.时间超过24，48小时是不是时间太长了？？
4.由于感觉种上后可能计数不完全准确，可否用胰酶将上室的细胞消化下来，再次计数，这样计算迁移率啊？？
多谢！

作者: dotaaa 时间: 2012-4-7 14:21

痰找脱落细胞应注意些什么？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:22

大使您好！我想问一下，我想利用转染后细胞做Transwell实验研究基因对细胞侵袭的影响。Corning 24孔小室应该加多少微升的基质胶？基质胶不太容易涂匀，您有什么好办法可以解决此问题？基质胶浓度为多少最为合适？转染后的细胞是瞬时转染还是稳定转染更适合于此研究？一般接种浓度和细胞悬液体积应该为多少？刚刚接触这个实验，做了几次结果都不理想，所以问题多了些，请大使见谅！盼望着您的回复！谢谢！

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感谢您的问题。Corning 24孔小室应该加多少微升的基质胶大家的看法不一样，从涂30微升到50微升的都有，只要是既要能包被膜又能完成细胞侵袭即可。基质胶不太容易涂匀，这的确是个问题，但是好像也只有多做几次才能把握其中的感觉。基质胶浓度也是根据您的细胞的侵袭力和个人的习惯来决定的，建议结合文献做预实验摸出条件。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:22

多谢指点！
我上室种的是10的5次方个细胞，300微升重悬，细胞数目应该不是很多。

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抱歉，看的不准确。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:22

我也在做Transwell，师兄留下来的板都被我预实验用完了，东方大使可以把Corning的购买联系方式告诉我吗？

另外再问个小问题，但是也是决定实验的重要因素，就是种板100ul的细胞悬液后，细胞都聚集在胶的中心部位，周围都没什么细胞，所以染色后，在小室的下腔也是在中间有细胞，这样得到的结果肯定也是不可靠的，不知有什么办法在种板的时候让细胞均匀呢？谢谢东方大使！

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细胞聚团也是个老问题，尤其是加液量少，小室的面积小（24孔板的transwell小室面积和96孔板的培养孔面积差不多）的时候这种效应更明显。可以考虑下加大加液量，另外轻轻地吹下。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:23

太感谢高手了，刚看到这个帖子，后悔晚矣

前几天我尝试做了transwell,但是遇到几个问题，已经看了前面的帖子，仍有不明白的地方，还望版主及东方朔帮助解答：
1.我开始是看说明书上，24孔板，8um,胶按照1：2稀释的，加了50ul.胶是不是太厚了
2.过夜后在膜层面上没有看到细胞，过了48小时发现在膜的那层“有一些圆形小珠”的这个层面上可以看到细胞的影子，但好像还是在上室，只是向下侵袭了一部分而已。问一下该如何更准确的判断到底是不是已经穿过膜?
3.时间超过24，48小时是不是时间太长了？？
4.由于感觉种上后可能计数不完全准确，可否用胰酶将上室的细胞消化下来，再次计数，这样计算迁移率啊？？
多谢！

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感谢您的问题。
1、这个浓度和量好像都高了些，您的细胞容易过去么？
2、可以查查文献，看看您这种细胞侵袭力如何，一般采用多长时间，还是您涂的胶太厚，胶太稠。判断过膜还是要擦掉上层细胞，对膜的下腔面染色，才能比较确定的判定。
3、时间的长短要结合多个实验因素来确定，以能拉开各个实验组间的差异为宜。
4、这样操作不太准确吧。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-4-7 14:23

楼主您好：
正准备开始做transwell的实验，有好多问题不是很清楚
1，请告知一下康宁公司的方式
2，我打算做两种干细胞的共培养，一个是上皮来源，一个是间充质来源，观察细胞的分化影响，两种都是贴壁细胞，请问细胞如何接种比较好？还有，大家提到的铺胶的问题，我这样细胞共培养实验用不用考虑？
3，后期细胞增殖MTT测定如何进行？RNA的提取等直接在膜上进行，还是要先消化细胞移到普通板上进行？
谢谢

作者: bluelake 时间: 2012-4-7 14:24

楼主：提个问题
transwell小室内的细胞（即所谓上层的细胞）如何取下来做检测呢？还是直接拿小室去做检测？谢谢

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-4-7 14:24

LZ这个帖实在是太及时了
我有个问题想请教：
一我现在在做在Transwell板上构建脐静脉内皮细胞单层的实验，请问构建这个单层的时候，Transwell板上需要预先包被基质胶吗？？
二细胞长到一定密度之后，有什么好的方法检测是否形成了完整的单层吗？
三做了好几次，有几次种的细胞数目稍微多些（大约十的五次方个细胞），细胞第二天就成团死亡了，是由于培养液有限不能提供足够的营养吗？？
不胜感激！！！

作者: 笑弯了腰 时间: 2012-4-7 14:24

还有一个问题 LZ你做过在Transwell板上构建好内皮细胞单层之后，检测内皮细胞单层的通透性的变化吗？
请问怎么检测这种单层的通透性变化呢？？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-7 14:25

楼主您好：
正准备开始做transwell的实验，有好多问题不是很清楚
1，请告知一下康宁公司的方式
2，我打算做两种干细胞的共培养，一个是上皮来源，一个是间充质来源，观察细胞的分化影响，两种都是贴壁细胞，请问细胞如何接种比较好？还有，大家提到的铺胶的问题，我这样细胞共培养实验用不用考虑？
3，后期细胞增殖MTT测定如何进行？RNA的提取等直接在膜上进行，还是要先消化细胞移到普通板上进行？
谢谢

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如果是细胞因子的作用话，一般是选用0.4um的6孔板做共培养的，细胞不穿过而细胞因子可以穿过，共培养一般情况下不需要铺胶。当然如果细胞相互作用是通过细胞接触的，那这个体系就不可以了。如果你又想测MTT又想提RNA，我看不如直接把细胞从膜上细胞化下来计数～然后再提RNA。计数的结果有时候比MTT要来的准。

作者: okhaha 时间: 2012-4-7 14:25

我也用transwell做过侵袭方面的试验，能否问一个不太相关的问题：

transwell做抗肿瘤药物抑制侵袭的试验，是一个体外试验，只是简单的模拟体内，不知楼主是否了解如何用体内试验研究药物的抗转移特性？

我知道一种类似的试验是小鼠尾静脉注射肿瘤细胞，然后给药，看肺结节评价药物活性，不过这种是人工转移肿瘤细胞直接到血液循环系统，跟人体真实的原发瘤到继发瘤还是有较大差距。

不知有没有这样一种肿瘤细胞，把它接种到小鼠皮下，过几天它自己就转移到肺，或肝，或其它地方，这样跟真实情况最接近。

不知楼主是否还了解其它体内抗转移方面的试验？

作者: 831226 时间: 2012-4-7 14:25

我也遇到了，细胞在小室中央成团，但是在小室内吹打细胞很容易弄坏基底膜？

作者: rxcc33 时间: 2012-4-7 14:26

我想请问，如果用倒置显微镜看转移到膜下的细胞，如何区分是膜上还是转移到膜下的细胞？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:26

楼主您好：
正准备开始做transwell的实验，有好多问题不是很清楚
1，请告知一下康宁公司的方式
2，我打算做两种干细胞的共培养，一个是上皮来源，一个是间充质来源，观察细胞的分化影响，两种都是贴壁细胞，请问细胞如何接种比较好？还有，大家提到的铺胶的问题，我这样细胞共培养实验用不用考虑？
3，后期细胞增殖MTT测定如何进行？RNA的提取等直接在膜上进行，还是要先消化细胞移到普通板上进行？
谢谢

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您好。
1、已经PM您了。
2、如果没有特殊要求，分别在培养板底和小室底部接种即可。只是共培养可以不铺胶，如果您的细胞非要铺胶才能养，则另当别论。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:27

楼主：提个问题
transwell小室内的细胞（即所谓上层的细胞）如何取下来做检测呢？还是直接拿小室去做检测？谢谢

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您要做什么检测呢？一般胰酶消化下来即可。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:27

LZ这个帖实在是太及时了
我有个问题想请教：
一我现在在做在Transwell板上构建脐静脉内皮细胞单层的实验，请问构建这个单层的时候，Transwell板上需要预先包被基质胶吗？？
二细胞长到一定密度之后，有什么好的方法检测是否形成了完整的单层吗？
三做了好几次，有几次种的细胞数目稍微多些（大约十的五次方个细胞），细胞第二天就成团死亡了，是由于培养液有限不能提供足够的营养吗？？
不胜感激！！！

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感谢您的交流。
1、人脐静脉内皮细胞有人铺胶也有人不铺，看您的实验是否需要了。
2、镜下看最直观
3、可以多加点培养液试试。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:27

我也用transwell做过侵袭方面的试验，能否问一个不太相关的问题：

transwell做抗肿瘤药物抑制侵袭的试验，是一个体外试验，只是简单的模拟体内，不知楼主是否了解如何用体内试验研究药物的抗转移特性？

我知道一种类似的试验是小鼠尾静脉注射肿瘤细胞，然后给药，看肺结节评价药物活性，不过这种是人工转移肿瘤细胞直接到血液循环系统，跟人体真实的原发瘤到继发瘤还是有较大差距。

不知有没有这样一种肿瘤细胞，把它接种到小鼠皮下，过几天它自己就转移到肺，或肝，或其它地方，这样跟真实情况最接近。

不知楼主是否还了解其它体内抗转移方面的试验？

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肿瘤的体内转移模型或者是侵袭试验，司徒镇强主编的那本《细胞培养》上有介绍，您可以看看。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:28

我也遇到了，细胞在小室中央成团，但是在小室内吹打细胞很容易弄坏基底膜？

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膜没那么脆弱，但是铺好的胶要小心一点。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:28

我想请问，如果用倒置显微镜看转移到膜下的细胞，如何区分是膜上还是转移到膜下的细胞？

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想看转移到膜下的细胞还是要靠染色比较准确。

作者: S6044 时间: 2012-4-7 14:29

版主辛苦了。我想咨询个问题，就是现在要做一些未知蛋白对造血干细胞（HSC）的趋化迁移作用，具体是把蛋白放在下室，HSC放在上室，看4h后的作用情况。所用的Corning 小室的膜要不要做特殊处理还是直接用? 用5um孔径的可行?是直接收集下室细胞观察还是需要擦除膜上面的细胞对下面的细胞进行染色观察呢？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:29

如果两种细胞都是贴壁生长，可以在膜的反正两面都种，这样部分细胞会透过孔有所接触。

请问选择多大的孔径才既不会让贴壁的细胞透过膜同时又允许细胞膜部分伸入膜中与另一面的细胞形成直接接触呢？0.4还是3.0微米？

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您好。个人觉得可能3微米孔径的膜更适合您的要求。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:30

版主辛苦了。我想咨询个问题，就是现在要做一些未知蛋白对造血干细胞（HSC）的趋化迁移作用，具体是把蛋白放在下室，HSC放在上室，看4h后的作用情况。所用的Corning 小室的膜要不要做特殊处理还是直接用? 用5um孔径的可行?是直接收集下室细胞观察还是需要擦除膜上面的细胞对下面的细胞进行染色观察呢？

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您好。HSC是悬浮细胞，可以不用特殊处理膜直接用，5微米的孔径可以的，直接收掉入下室的细胞即可。

作者: 铜雀 时间: 2012-4-7 14:30

如何提高灵敏度及特异性是一个开发高标准

作者: qhyu 时间: 2012-4-7 14:31

一种贴壁细胞，一种是悬浮细胞，我想看悬浮细胞分泌的因子对贴壁细胞有什么作用能达到不？需要排除悬浮细胞透过透膜直接接触到贴壁细胞引起的接触产生的作用？

作者: baidukk 时间: 2012-4-7 14:31

你好！我是刚用Transwell做肿瘤细胞对脐静脉内皮细胞的作用的实验。我想问一下上下分别加多少培养基为宜？
谢谢

作者: 小螺号 时间: 2012-4-7 14:31

听说过transwell
前段时间还听过一个snapwell
不知道两者有何区别？

多谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:32

一种贴壁细胞，一种是悬浮细胞，我想看悬浮细胞分泌的因子对贴壁细胞有什么作用能达到不？需要排除悬浮细胞透过透膜直接接触到贴壁细胞引起的接触产生的作用？先感谢下河lgw12198@gmail.com

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您好。使用0.4微米膜孔径的transwell把这两种细胞共培养即可。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:32

你好！我是刚用Transwell做肿瘤细胞对脐静脉内皮细胞的作用的实验。我想问一下上下分别加多少培养基为宜？
谢谢

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您好。加多少液体要根据您选用的transwell的规格确定，以下是Corning的transwell的一些参数，供您参考：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11540

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:32

听说过transwell
前段时间还听过一个snapwell
不知道两者有何区别？

多谢！

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您好。和大家一起学习下。

图片附件: 44372470.jpg (2012-4-7 14:32, 53.81 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11541

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 14:33

听说过transwell
前段时间还听过一个snapwell
不知道两者有何区别？

多谢！

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您好。和大家一起学习下。

图片附件: 50330382.jpg (2012-4-7 14:33, 15.87 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11542

作者: zranqi_1 时间: 2012-4-7 14:33

呃，问LZ一个很幼稚的问题。之前我们购买的时候错买成0.4微米的transwell,可是我们要做MSC的迁移实验，请问我们这种情况可以联系康宁公司进行换货么？

作者: glass 时间: 2012-4-7 14:34

您好，我想问一下，只能用荧光显微镜或相差显微镜来观察计数&拍照？一般的倒置显微镜不能，是不是啊？（新手，要做此实验，但是器材都不够用，实验室也没人做过）谢谢啊！

作者: woshituzhu 时间: 2012-4-7 15:31

看到一篇中文文献提到：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室，膜孔0.4μm；传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室，讨论中说新式为接触共培养，传统为非接触共培养
个人理解为去掉挂壁是使小室直接接触到板底的细胞，但为何选0.4um而不是3.0um?另外这样的接触和膜的正反面都种细胞有何不同？取出小室时会带出板底的细胞么？

作者: abc816 时间: 2012-4-7 15:32

谢谢！
我还想问一下。我在Transwell上种细胞，用的是聚碳酯(PC)那种。由于看不到细胞是否贴壁，需不需要担心这个问题（细胞在板上长的很好）。

作者: chuntian1983 时间: 2012-4-7 15:32

您好，我做miRNA 对结肠癌HCT-116细胞迁移和侵袭的影响，发现用miRNA inhibitor抑制特定的miRNA后，HCT-116迁移能力降低了，但是侵袭力增加了，似乎和别人发表的文章不一样（大多是一个药物对侵袭和迁移的影响是一致的，即：药物处理后，迁移力增强，侵袭力也增强；反之，迁移力减弱，侵袭力也减弱），请问，这种现象能合理解释吗？（注：我的实验中，迁移的过来的细胞相对多点，而侵袭过来的细胞比较少）。非常感谢！

作者: yes4 时间: 2012-4-7 15:32

您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，请问要用多少微米的膜孔呢？药物最长刺激时间是24小时，我是用含血清培养基、含钙液、0PTI-MEN还是其他的呢？我想设固定组，用多聚甲醛，请问要固定多长时间才能让细胞死亡呢？。谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 15:33

您好，我想问一下，只能用荧光显微镜或相差显微镜来观察计数&拍照？一般的倒置显微镜不能，是不是啊？（新手，要做此实验，但是器材都不够用，实验室也没人做过）谢谢啊！

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能看见活细胞的就可以。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 17:07

看到一篇中文文献提到：新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室，膜孔0.4μm；传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室，讨论中说新式为接触共培养，传统为非接触共培养
个人理解为去掉挂壁是使小室直接接触到板底的细胞，但为何选0.4um而不是3.0um?另外这样的接触和膜的正反面都种细胞有何不同？取出小室时会带出板底的细胞么？

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呵呵。您完全可以给作者写信讨论一下。个人对此做法持保留态度。估计取出小室的时候，多少会带出一些板底部的细胞。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 17:07

谢谢！
我还想问一下。我在Transwell上种细胞，用的是聚碳酯(PC)那种。由于看不到细胞是否贴壁，需不需要担心这个问题（细胞在板上长的很好）。

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Transwell的膜是经过处理的，适合细胞生长，您不用担心这个问题。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 17:08

您好，我做miRNA 对结肠癌HCT-116细胞迁移和侵袭的影响，发现用miRNA inhibitor抑制特定的miRNA后，HCT-116迁移能力降低了，但是侵袭力增加了，似乎和别人发表的文章不一样（大多是一个药物对侵袭和迁移的影响是一致的，即：药物处理后，迁移力增强，侵袭力也增强；反之，迁移力减弱，侵袭力也减弱），请问，这种现象能合理解释吗？（注：我的实验中，迁移的过来的细胞相对多点，而侵袭过来的细胞比较少）。非常感谢！

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如果您重复了多次，并且各个实验处理组之间趋势始终一致，就可以确定。也可以请同学帮助您操作，排除个人实验技术原因。

如果是这样，您在讨论部分就要好好解释了，恐怕要有相关的实验数据来支持才行。

作者: kulee 时间: 2012-4-7 17:21

您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，我用多少微米的膜孔好些呢？我用药物刺激细胞最长时间是24小时，请问我是用含血清培养基、含钙液、OPTI-MEN还是其他的呢？我要设定一个固定组，用多聚甲醛固定细胞，要作用多长时间才能将细胞杀死呢？谢谢了！

作者: pengke1983 时间: 2012-4-7 17:28

您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，我用多少微米的膜孔好些呢？我用药物刺激细胞最长时间是24小时，请问我是用含血清培养基、含钙液、OPTI-MEN还是其他的呢？我要设定一个固定组，用多聚甲醛固定细胞，要作用多长时间才能将细胞杀死呢？谢谢了！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 17:28

您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，我用多少微米的膜孔好些呢？我用药物刺激细胞最长时间是24小时，请问我是用含血清培养基、含钙液、OPTI-MEN还是其他的呢？我要设定一个固定组，用多聚甲醛固定细胞，要作用多长时间才能将细胞杀死呢？谢谢了！

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"您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，我用多少微米的膜孔好些呢？我用药物刺激细胞最长时间是24小时，请问我是用含血清培养基、含钙液、OPTI-MEN还是其他的呢？"
可以具体一点介绍一下您的实验设计么？
如果用多聚甲醛固定单细胞层，1%的浓度，几分钟即可。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-7 17:45

帮助您好，我想利用transwell想做细胞之间联系的实验，我怎么样可以观察到transwell半透膜下面与底层之间的细胞之间立体结构关系呢？谢谢

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不太明白，什么是立体结构关系呢？

作者: yychen 时间: 2012-4-7 17:45

我用24孔板的transwell小室做侵袭实验，8微米的孔径，种的HCT116细胞，但是细胞老是不能穿过膜，每次用棉签一擦细胞就全没有了。想请问一下美女大使，是怎么一回事呢？我在上室中加入的是1；8稀释的matrigel 80ul,会不会是matrigel过多的原因呢？

作者: nn255 时间: 2012-4-7 17:45

看到楼主也做DC，真是欣喜若狂。我有如下问题想要请教：
我把DC和巨噬细胞分别与其他细胞共培养，DC和巨噬细胞是放在上腔吗？如果滤膜反复使用的话，要怎么消毒（我们没有超声机）？6孔板只要是康宁的都可以匹配吗？
麻烦您把订货的方式给我吧~
万分感谢！

作者: BUK 时间: 2012-4-7 17:46

我想问一下侵袭和迁移实验的评价指标各是什么？谢谢

作者: october7 时间: 2012-4-7 17:46

各位好

我在用corning的24孔transwell小室做上皮细胞的培养，由于需要对上皮细胞进行鉴定，想把膜取下来包埋做免疫组化，我想用手术刀沿着底部划一圈把膜取下，结果发现划到半圈的时候膜就卷起来了，而且再也难以铺平。

各位有没有什么小技巧可以很好的把膜取下呢？

多谢啦！

作者: junhun 时间: 2012-4-7 17:46

你好，我也准备做肿瘤细胞侵袭、迁移实验。用的是CasKi细胞，请问需要选择什么型号的小室。趋化因子怎么选？

作者: ero11 时间: 2012-4-7 17:47

老师，你好，想请教个问题，transwell一般不能在显微镜下观察，我用的的适于24孔板的transwell，我的实验要求需要细胞在孔板内平铺生长成单层后再加处理因素。那么我们怎么确保将细胞加入transwell后，细胞能够分布均匀，同时又能够单层生长呢？因为接种普通的24孔板，细胞就不容易均匀分布。所以想请教老师，给予指点！谢谢

作者: ero11 时间: 2012-4-7 17:49

还有一个问题 LZ你做过在Transwell板上构建好内皮细胞单层之后，检测内皮细胞单层的通透性的变化吗？
请问怎么检测这种单层的通透性变化呢？？

期待做过的群友来讨论。

有两种方法，一种利用测跨上皮电阻测定电阻值，看单层细胞电阻值的改变
第二种方法是测定细胞旁渗透性，就是在上室加入有FITC标记的物质，过特定的时间在下室的培养液中检测上述物质的含量，从而评估物质在细胞的转运能力，从而反映细胞的通透性。

作者: milkdog 时间: 2012-4-7 17:50

看了LZ给的照片，我觉得是自己买的膜存在问题，还是找不到上室细胞~~准备换用Corning公司的，麻烦楼主M我联系方式，谢谢啦~~

作者: milkdog 时间: 2012-4-7 17:50

by the way：我做两种贴壁细胞的共培养是不是用0.4um的PET膜Transwell就ok啦？谢~~

作者: utt0989 时间: 2012-4-7 17:51

刚刚接触到Transwell，想请教一下：1.上室培养液要用无血清的吗？我做的是细胞共培养，上室不加血清细胞可以成活吗？2.镜下看的时候，通过调焦，看到膜的层面黑乎乎的，看不清细胞，是怎么回事呢？

客气了。
1、较长时间的细胞共培养，无论上腔还是下腔都要用含血清培养基;
2、如果您选用的是透明的膜，应该是可以看见的。

多谢指导！透过膜可以看到下室细胞的，现在问题是我找不到膜层面（上室）的细胞（贴壁细胞），现上传两张图片，看一下这是膜吗？谢谢~~

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我觉得有一个办法可以解决无法分辨膜上细胞结构的方法，我曾买过millipore的细胞小室，0.4的透明度较差，但0.8的却能透过细胞小室清楚看见六孔板的底部的细胞，但小室底部的细胞结构确实辨认不清，我也曾为此困扰。
有一次一位同学的建议让我茅塞顿开，他建议我把滋养层细胞种在小室内，而需要培养的细胞则种在六孔板底，这样岂不是解决了细胞不易辨认的缺点。不过还未证实，但我觉得应该是可行的。大家可以试一下。

作者: qumm1985 时间: 2012-4-7 17:51

楼主你好。我想做间充质干细胞对造血干细胞增殖分化的影响，具体是把间充质放在下室，HSC放在上室，我应该选什么样的板，具体的上下室放多少体积的液体？谢谢

作者: 911 时间: 2012-4-7 17:52

想问一个很浅显的问题，transwell在倒置显微镜下能看到种在膜上的细胞，那细胞穿过膜后，怎么观察呢？我看别人写的是把小室倒过来来镜下看，可是看不清楚了啊？

作者: zzzz 时间: 2012-4-7 17:52

您好，楼主，我是个研一新手，现在需要做RAW264.7在刺激后的迁移功能方面的实验，所以想请教您：
迁移功能的测定，我查了文献是用MCP-1(60ng/ml)作为趋化因子，但文献支持很少，恳求您的建议或经验，若不用MCP-1，可以用什么别的来代替吗？因为我的实验刚开始做，真的是极其幼稚，所以，感激不尽！！

作者: owanaka 时间: 2012-4-7 17:52

楼主您好~！
想问一下我要做的是在上层养ht-29（结肠腺癌上皮细胞），要贴着膜，下层养神经细胞，也得贴着膜。按照您说的那种反转小室后种上细胞，培养后需要把膜下层贴壁生长的神经元刮除，去测膜和膜上长着的HT-29的转运能力。（需要把膜和ht-29一起从小室底部分离出来去上仪器）请问这是否能实现？如何去除膜下面生长的神经元细胞呢？用酶去消化？刮除？如何把膜给分离下来呢？手术刀割开？
谢谢楼主啦

作者: october7 时间: 2012-4-7 17:54

细胞划痕的原理是什么？？谁知道！谢谢`！

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:54

"您好，我做脂蛋白穿胞实验，用的是脐静脉内皮细胞，我用多少微米的膜孔好些呢？我用药物刺激细胞最长时间是24小时，请问我是用含血清培养基、含钙液、OPTI-MEN还是其他的呢？"
可以具体一点介绍一下您的实验设计么？
如果用多聚甲醛固定单细胞层，1%的浓度，几分钟即可。

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我们用0.4微米 PET膜的小WELL，没铺胶。先用培养基养细胞，加药刺激前换成等量的含钙液或者OPTI-MEM养细胞，后加入带有荧光标记的脂蛋白，按时间取样于黑色96孔板后检测，进行比较。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:55

版主，不知现在这个活动还在进行吗？
我用24孔板的transwell小室做侵袭实验，8微米的孔径，种的HCT116细胞，但是细胞老是不能穿过膜，每次用棉签一擦细胞就全没有了。想请问一下美女大使，是怎么一回事呢？我在上室中加入的是1；8稀释的matrigel 80ul,会不会是matrigel过多的原因呢？

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您好。个人觉得可能的原因有：matrigel胶太厚，超出了细胞的侵袭能力，以至于到达膜下腔面的细胞基本没有；下层的趋化因素不足；趋化的时间太短等等。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:56

看到楼主也做DC，真是欣喜若狂。我有如下问题想要请教：
我把DC和巨噬细胞分别与其他细胞共培养，DC和巨噬细胞是放在上腔吗？如果滤膜反复使用的话，要怎么消毒（我们没有超声机）？6孔板只要是康宁的都可以匹配吗？
麻烦您把订货的方式给我吧~
万分感谢！

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您好。我是把一种贴壁细胞种在下腔，然后把单核细胞种在上腔的，没问题。其实，滤膜是不推荐长期反复使用的，尤其是0.4微米孔径的，用来长时间共培养的transwell。我把短时间迁移且不铺胶用后的transwell重复用过几次。后来担心有细胞成分堵塞了微孔，就没有继续用。6孔板只要是康宁的都可以匹配。
Corning的联系方式我PM给您了。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:56

我想问一下侵袭和迁移实验的评价指标各是什么？谢谢

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一般是计算在一定趋化强度下，和一定时间内，到达下腔或者下腔面的细胞数。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:57

你好，我也准备做肿瘤细胞侵袭、迁移实验。用的是CasKi细胞，请问需要选择什么型号的小室。趋化因子怎么选？

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您好。常见的Coring的transwell小室有适用于24孔板的，6孔板的等多种规格。选择时，以能满足实验需要，又要进可能节约实验体系，方便统计学处理为考虑目标。

比如您的培养体系比较宝贵，那显然选择24孔板比6孔板要经济些。而且，一块板上的小室数目多，也比较容易满足统计学分析的要求。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:57

老师，你好，想请教个问题，transwell一般不能在显微镜下观察，我用的的适于24孔板的transwell，我的实验要求需要细胞在孔板内平铺生长成单层后再加处理因素。那么我们怎么确保将细胞加入transwell后，细胞能够分布均匀，同时又能够单层生长呢？因为接种普通的24孔板，细胞就不容易均匀分布。所以想请教老师，给予指点！谢谢

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您好。欢迎您的交流。
感谢您的问题。其实这个问题不用担心。的确，24孔板的transwell的小室膜生长面积和96孔板的差不多，在这么小的孔内种细胞容易受到液体表面张力的影响，导致细胞聚集在孔中间。
个人觉得可以尝试下：1、在上腔内多加点培养基 2、确保种的是单细胞悬液 3、种完后再轻轻吹打下，要轻些。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:58

by the way：我做两种贴壁细胞的共培养是不是用0.4um的PET膜Transwell就ok啦？谢~~

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是的。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:59

我觉得有一个办法可以解决无法分辨膜上细胞结构的方法，我曾买过millipore的细胞小室，0.4的透明度较差，但0.8的却能透过细胞小室清楚看见六孔板的底部的细胞，但小室底部的细胞结构确实辨认不清，我也曾为此困扰。
有一次一位同学的建议让我茅塞顿开，他建议我把滋养层细胞种在小室内，而需要培养的细胞则种在六孔板底，这样岂不是解决了细胞不易辨认的缺点。不过还未证实，但我觉得应该是可行的。大家可以试一下。

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值得一试。

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:59

楼主你好。我想做间充质干细胞对造血干细胞增殖分化的影响，具体是把间充质放在下室，HSC放在上室，我应该选什么样的板，具体的上下室放多少体积的液体？谢谢

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您好。您可以选择0.4微米膜孔径的PET板，这样较长时间的共培养中，您还可以观察细胞尤其是膜上细胞的状态。关于各规格上下室放多少液体量，请看下图

图片附件: 55244041.jpg (2012-4-7 17:59, 24.83 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11543

作者: idea2011 时间: 2012-4-7 17:59

想问一个很浅显的问题，transwell在倒置显微镜下能看到种在膜上的细胞，那细胞穿过膜后，怎么观察呢？我看别人写的是把小室倒过来来镜下看，可是看不清楚了啊？

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染色。

倒过来镜下看完了之后，怎么办？还继续养么？还是就这样计数，能方便计数么？愿闻其详。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:25

您好，楼主，我是个研一新手，现在需要做RAW264.7在刺激后的迁移功能方面的实验，所以想请教您：
迁移功能的测定，我查了文献是用MCP-1(60ng/ml)作为趋化因子，但文献支持很少，恳求您的建议或经验，若不用MCP-1，可以用什么别的来代替吗？因为我的实验刚开始做，真的是极其幼稚，所以，感激不尽！！

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您好。欢迎您来交流。

RAW264.7是小鼠单核/巨噬细胞系细胞。建议您详细看看金伯泉主编的《细胞和分子免疫学》-趋化因子那一章，对于多种相关趋化因子都有介绍。或者找一本相似的教材看看也都有介绍。
实在不行，找篇最新的相关的综述看看。

另外，还是要多看些文献，看看对于单核/巨噬细胞有趋化作用的那些因子，在相关的实验中都怎么用。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:26

楼主您好~！
想问一下我要做的是在上层养ht-29（结肠腺癌上皮细胞），要贴着膜，下层养神经细胞，也得贴着膜。按照您说的那种反转小室后种上细胞，培养后需要把膜下层贴壁生长的神经元刮除，去测膜和膜上长着的HT-29的转运能力。（需要把膜和ht-29一起从小室底部分离出来去上仪器）请问这是否能实现？如何去除膜下面生长的神经元细胞呢？用酶去消化？刮除？如何把膜给分离下来呢？手术刀割开？
谢谢楼主啦!

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1。用棉签可以把不要的贴壁细胞擦掉，需检测的贴壁细胞可以再随后以酶消化；
2、可以用剪子或者小刀取下膜。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:26

我们用0.4微米 PET膜的小WELL，没铺胶。先用培养基养细胞，加药刺激前换成等量的含钙液或者OPTI-MEM养细胞，后加入带有荧光标记的脂蛋白，按时间取样于黑色96孔板后检测，进行比较。

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可以选用0.4微米的膜孔径的transwell.

关于加药刺激前培养体系的选择，期待有经验的群友来解答。

作者: S6044 时间: 2012-4-9 12:27

您好，
我将要做细胞共培养的实验，需要用到Transwell。我培养两种细胞，一种细胞（A细胞）产生细胞因子对另一种细胞（B细胞）产生作用。两种细胞都是贴壁细胞。请问两种细胞的培养基不同能共培养吗？A细胞是在上层还是在下层好？
谢谢大使！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:28

您好，
我将要做细胞共培养的实验，需要用到Transwell。我培养两种细胞，一种细胞（A细胞）产生细胞因子对另一种细胞（B细胞）产生作用。两种细胞都是贴壁细胞。请问两种细胞的培养基不同能共培养吗？A细胞是在上层还是在下层好？
谢谢大使！

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您好。感谢您来交流。

1、我培养两种细胞，一种细胞（A细胞）产生细胞因子对另一种细胞（B细胞）产生作用。两种细胞都是贴壁细胞。请问两种细胞的培养基不同能共培养吗？

可以的，一般要根据细胞营养需要，照顾营养需求高的那种细胞。

2、A细胞是在上层还是在下层好？

如果没有特殊情况，把A种在下层。这样下层的细胞生长面积大，细胞数量可以在较大的范围内选择，方便考察量效关系。具体一点说，即A：B的比例，可以把B的数量固定，而A可以在一定范围内变动。

作者: 8princess8 时间: 2012-4-9 12:29

楼主，您好我也想要康宁公司（中国）代理商的联系方式。另外，CasKi肿瘤细胞侵袭、迁移实验要选多大孔径的好？CasKi细胞有特定的趋化因子吗？谢谢！

作者: zhenxin 时间: 2012-4-9 12:30

因为24孔的小室比较小，细胞悬液加入后容易成团在小室中央，今天对比了一下上室中加100ul和200ul的细胞悬液，感觉200ul的细胞悬液加入后在上室分布比较均匀，效果较好，最好一次贴壁匀速加入。

作者: ending 时间: 2012-4-9 12:30

老师，麻烦问一下，我前面说的用0.4um孔径的transwell板来分析间充质干细胞对HSC的刺激增殖作用，因为最后要计数上室细胞及对其比例进行分析。但是计数要考虑到有很多的HSC黏附在上膜上，也就是怎么把膜上细胞全部搞下来，准确计数呢

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-9 12:30

老师，麻烦问一下，我前面说的用0.4um孔径的transwell板来分析间充质干细胞对HSC的刺激增殖作用，因为最后要计数上室细胞及对其比例进行分析。但是计数要考虑到有很多的HSC黏附在上膜上，也就是怎么把膜上细胞全部搞下来，准确计数呢

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胰酶消化,没有问题的.

作者: 969 时间: 2012-4-9 12:31

我的试剂商说是Corning的0.4umTranswell全国缺货@晕了~~
立马定了Greiner的插入式培养皿，PET膜，外观貌似比millipore的透明些~~具体怎样，待观吧~~~顺便问，0.4um的孔径，镜下应该看不到孔吧？可是偶咋觉得能看到小小圈圈孔孔呢~~

作者: 阿司匹林 时间: 2012-4-9 12:32

老师，你好，想请教个问题，transwell一般不能在显微镜下观察，我用的的适于24孔板的transwell，我的实验要求需要细胞在孔板内平铺生长成单层后再加处理因素。那么我们怎么确保将细胞加入transwell后，细胞能够分布均匀，同时又能够单层生长呢？因为接种普通的24孔板，细胞就不容易均匀分布。所以想请教老师，给予指点！谢谢

您好。欢迎您的交流。
感谢您的问题。其实这个问题不用担心。的确，24孔板的transwell的小室膜生长面积和96孔板的差不多，在这么小的孔内种细胞容易受到液体表面张力的影响，导致细胞聚集在孔中间。
个人觉得可以尝试下：1、在上腔内多加点培养基 2、确保种的是单细胞悬液 3、种完后再轻轻吹打下，要轻些。

谢谢老师的解答，也谢谢老师的投票！嘻嘻！
我会尽量尝试，准备下室加600ul，上室加200ul，有问题再请教！

作者: Ao7 时间: 2012-4-9 12:32

老师，您好！
我之前看过您的回复里说小WELL的重复使用，先用胰酶把细胞消化下来，之后多洗两次，再用酒精泡一下，之后紫外灯下照就可以再次使用。
我想问一下，胰酶消化、酒精泡、紫外灯照各需多长时间呢？如果是放了一段时间的，孔里都干了的那种也可以这样做吗？细胞消化后是用PBS或者D-Hanks洗吗？这些操作对膜没什么影响吗？（我们用的是0.4um的PET膜）
谢谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:33

楼主，您好我也想要康宁公司（中国）代理商的联系方式。另外，CasKi肿瘤细胞侵袭、迁移实验要选多大孔径的好？CasKi细胞有特定的趋化因子吗？谢谢！

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1、楼主，您好我也想要康宁公司（中国）代理商的联系方式
已经PM您了。

2、另外，CasKi肿瘤细胞侵袭、迁移实验要选多大孔径的好？
可以试试8微米膜孔径的。

3、CasKi细胞有特定的趋化因子吗？
这个要靠您自己看文献。在您的研究方向上，您应该是专家。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:33

老师，麻烦问一下，我前面说的用0.4um孔径的transwell板来分析间充质干细胞对HSC的刺激增殖作用，因为最后要计数上室细胞及对其比例进行分析。但是计数要考虑到有很多的HSC黏附在上膜上，也就是怎么把膜上细胞全部搞下来，准确计数呢

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也可以试试用含有EDTA的冷PBS。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:34

我的试剂商说是Corning的0.4umTranswell全国缺货@晕了~~
立马定了Greiner的插入式培养皿，PET膜，外观貌似比millipore的透明些~~具体怎样，待观吧~~~顺便问，0.4um的孔径，镜下应该看不到孔吧？可是偶咋觉得能看到小小圈圈孔孔呢~~

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期待您的PP。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:35

老师，您好！
我之前看过您的回复里说小WELL的重复使用，先用胰酶把细胞消化下来，之后多洗两次，再用酒精泡一下，之后紫外灯下照就可以再次使用。
我想问一下，胰酶消化、酒精泡、紫外灯照各需多长时间呢？如果是放了一段时间的，孔里都干了的那种也可以这样做吗？细胞消化后是用PBS或者D-Hanks洗吗？这些操作对膜没什么影响吗？（我们用的是0.4um的PET膜）
谢谢！

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您好。个人认为如果是悬浮细胞，并且孔径在5微米或者8微米，可以尝试一下。但是如果是贴壁细胞，则很难完全把细胞成分去除，尤其是0.4微米膜孔径的transwell，如果有消化不完全残留的细胞碎片堵塞了孔，则有可能影响您下一次的实验结果，得不偿失。

作者: toy 时间: 2012-4-9 12:35

请问各位老师，若是研究抗肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭实验，可从哪些方面研究其机理呢？比如说MMPS的表达??谢谢回答啊！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:36

请问各位老师，若是研究抗肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭实验，可从哪些方面研究其机理呢？比如说MMPS的表达??谢谢回答啊！

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可以说的更详细一点吗？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:36

请问各位老师，若是研究抗肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭实验，可从哪些方面研究其机理呢？比如说MMPS的表达??谢谢回答啊！

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如果是围绕MMPS做，可以尝试观察MMPS对某种肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭能力的影响，常规策略包括overexpression 和 knock down MMPS之后，观察相关肿瘤细胞生物学特性的变化等等。

作者: 49888 时间: 2012-4-9 12:37

hoho

图片附件: 67449879.snap.jpg (2012-4-9 12:37, 72.92 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11546

作者: 49888 时间: 2012-4-9 12:38

高倍镜下pp~~~

图片附件: 54020493.snap.jpg (2012-4-9 12:38, 83.13 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11547

作者: glass 时间: 2012-4-9 12:38

我是想做一个新药的抗肿瘤转移课题，初步想法是用transwell来做此药对肿瘤细胞粘附、侵袭、迁移的影响。但是若再继续做机理研究，就不知道从何下手了。看了不少文献，感觉传导通路和影响因素真多，也看不懂，望您指点一二！谢谢您！（研一快结束，课题未开始，急啊！）

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-9 12:39 标题: 回复 #255 glass 的帖子

粘附的东西太多了~~很难从无到有的筛选出来靶点.可以选用背景较明确的细胞,筛下,如某细胞主要通过高表达整合素某成员而迁移粘附增强等等,或者直接上芯片.

作者: october7 时间: 2012-4-9 12:40

将transwell小室翻转过来在膜的小室外侧一面培养细胞的时候（需要在膜的两面贴壁细胞），怎样把膜上的细胞浸入培养基呢？
多谢！

作者: glass 时间: 2012-4-9 12:40

上芯片或许不可能了，这个一点也不懂，就做一下基础药理研究就可以吧？这个药主要和G家族蛋白相关，或许我可以从此传导通路下手查找与细胞运动相关的因子，您看这样可以不？（门外汉搞药理，有些头疼！）

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:41

高倍镜下pp~~~

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高倍的这张有点意思。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:41

将transwell小室翻转过来在膜的小室外侧一面培养细胞的时候（需要在膜的两面贴壁细胞），怎样把膜上的细胞浸入培养基呢？
多谢！

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呵呵，这里是大家交流实验经验的场所，可没有大牛。

您可以少量多次往膜上滴培养基。

作者: zranqi_1 时间: 2012-4-9 12:44

高倍的这张有点意思。

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觉得能看到小孔径，但不确定是不是，hoho~~还有一些累类杂质的东西

作者: october7 时间: 2012-4-9 12:45

呵呵，这里是大家交流实验经验的场所，可没有大牛。

您可以少量多次往膜上滴培养基。

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嗯这样啊，我开始也这么想过后来怕膜的通透性太好，培养基哗啦哗啦就漏下去了

作者: ladyhuahua 时间: 2012-4-9 12:45

版主，您好！我现在有个问题想请教，是很低级的问题。请问配制Matrigel胶，就是把胶稀释一般要稀释成什么浓度的？有要求的吗？谢谢！

作者: 社会主义好 时间: 2012-4-9 12:46

请问侵袭实验后，对穿过小室的细胞进行HE染色的具体步骤和注意事项？谢谢指点！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:46

嗯这样啊，我开始也这么想过后来怕膜的通透性太好，培养基哗啦哗啦就漏下去了

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不会这么容易漏的啦。呵呵。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 12:46

请问侵袭实验后，对穿过小室的细胞进行HE染色的具体步骤和注意事项？谢谢指点！

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您好。

您可以用棉签擦去膜上腔面的胶和细胞，然后将小杯置入95％乙醇中固定10min，然后按照
苏木精8-10分钟→自来水洗→75%盐酸乙醇分化30秒→自来水洗→温水（50-60℃）水5分钟（加速复蓝）→95%乙醇1分钟→伊红乙醇液1-2分钟这个步骤来进行染色。

75%盐酸乙醇分化液为盐酸0.5ml 加入75%乙醇100ml，此液要新鲜配制，如放置一段时间则要延长分化时间。

此外，各个实验室可能有自己习惯的protocol，以上供您参考。

作者: 大白菜 时间: 2012-4-9 12:47

请教前辈：transwell细胞迁移的原理？transwell上下室的药物或生长因子浓度何时能达到一致？谢谢！

作者: jujuba 时间: 2012-4-9 12:54

急：想请教版主，transwell细胞迁移实验，对于不铺胶的小室，多长时间上下室培养液会一致，也就是下室的药物需要多长时间跟上室之间没有梯度？谢谢。

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-9 12:56

急：想请教版主，transwell细胞迁移实验，对于不铺胶的小室，多长时间上下室培养液会一致，也就是下室的药物需要多长时间跟上室之间没有梯度？谢谢。

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一般来说24h,很少有transwell时间超过24h的

作者: 小鱼鱼 时间: 2012-4-9 12:57

终于把实验的前期准备弄好了
我想研究神经元分泌的因子对肠上皮细胞的影响
需要神经元和上皮细胞贴在膜的两面
但是原代神经元比较难贴壁
能不能将神经元种在小室里，把上皮细胞种在膜的另一面？
还想请教一下，I型胶原、明胶、聚赖氨酸这三种对原代神经元而言，哪种用来铺胶更适合？需要多大的浓度？（前面帖子里面提到I型胶原的是0.01%，但在某篇文献看到是2.5ug/ml，在“Transwell侵袭实验总结”帖子中，胶原的浓度为0.5mg/mL，同样，明胶的浓度也各有说法）
神经元生长的时候长出的突触会插入胶中么？上述的三种铺胶材料对分泌的因子通透性如何？
另外，12 well的transwell(1.12cm^2)，铺胶应该用多少ul呢？看到24孔（0.33cm^2）建议的是200ul左右，按面积来算是不是应该200*1.12/0.33=678ul,差不多700ul左右？

作者: star#room 时间: 2012-4-9 12:57

可以把神经元细胞种在receiver plate里，没必要种到膜反面，效果一样的。

作者: jrwyyplt 时间: 2012-4-9 12:58

可以把神经元细胞种在receiver plate里，没必要种到膜反面，效果一样的。

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主要是上仪器的时候要PET膜连着上皮层和神经元那一层一起
所以得种在膜的两面

作者: 3648755 时间: 2012-4-9 12:59

请问版主，怎么才知道上室内的细胞擦净了呢，镜下观察时怎么分辨是上室还是下室的细胞呢？非常感谢！

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:00

终于把实验的前期准备弄好了
还有问题想请教版主和大使
我想研究神经元分泌的因子对肠上皮细胞的影响
需要神经元和上皮细胞贴在膜的两面
但是原代神经元比较难贴壁
能不能将神经元种在小室里，把上皮细胞种在膜的另一面？
还想请教一下，I型胶原、明胶、聚赖氨酸这三种对原代神经元而言，哪种用来铺胶更适合？需要多大的浓度？（前面帖子里面提到I型胶原的是0.01%，但在某篇文献看到是2.5ug/ml，在“Transwell侵袭实验总结”帖子中，胶原的浓度为0.5mg/mL，同样，明胶的浓度也各有说法）
神经元生长的时候长出的突触会插入胶中么？上述的三种铺胶材料对分泌的因子通透性如何？
另外，12 well的transwell(1.12cm^2)，铺胶应该用多少ul呢？看到24孔（0.33cm^2）建议的是200ul左右，按面积来算是不是应该200*1.12/0.33=678ul,差不多700ul左右？
多谢版主和大使

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您好。
个人没有做过神经元的培养，只是大概知道，不包被的话，原代神经元很难贴壁，所以能说的也不多，欢迎有经验的站友来参与讨论。

作者: any333 时间: 2012-4-9 13:00

我们做神经元细胞用多聚赖氨酸包被，内皮细胞用0.9mg/mlI型胶原包被

作者: utt0989 时间: 2012-4-9 13:00

谢谢楼主的无私分享。
刚接触transwell，最近想做一个实验：在肿瘤细胞膜上表达一蛋白后，检测吞噬细胞或DC对其的摄取是否会加强，请问楼主，做transwell是否合适？

作者: 101010 时间: 2012-4-9 13:01

请问楼主用乙醇或甲醇固定细胞时，甲醇、乙醇浓度多少，直接将小室放入其中泡着？还是滴几滴在小室上，固定多次时间，谢谢

作者: 66小飞侠 时间: 2012-4-9 13:01

请问楼主用结晶紫染色的具体方法步骤

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:01

谢谢楼主的无私分享。
刚接触transwell，最近想做一个实验：在肿瘤细胞膜上表达一蛋白后，检测吞噬细胞或DC对其的摄取是否会加强，请问楼主，做transwell是否合适？

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您好。
请问该蛋白只是膜蛋白而非外泌蛋白么？

如果不能外泌，是否直接共同培养，摄取的机会更多些？

欢迎高手来讨论。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:02

请问楼主用乙醇或甲醇固定细胞时，甲醇、乙醇浓度多少，直接将小室放入其中泡着？还是滴几滴在小室上，固定多次时间，谢谢

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您好。个人所在实验室已经不用结晶紫染色观察迁移过去的细胞，而是采用用纯甲醇固定15分钟左右再染的DEPI。把培养体系吸出后，可以直接把甲醇加入细胞培养孔固定。

作者: ROSE李 时间: 2012-4-9 13:02

谢谢楼主回复。
该蛋白是膜蛋白。
如果是直接把表达该蛋白的肿瘤细胞和巨噬细胞或DC细胞共同培养，检测吞噬率当然更直接。老板想让我做transwell.我想很大程度上是想把这一技术在实验室建立起来。
按照假设，在肿瘤细胞表达目的蛋白后，DC或巨噬细胞应该会向肿瘤细胞迁移，如果是这样的话，做transwell中的细胞趋化实验或细胞迁移实验是否合适?或者楼主有没有更好的建议？
另外想问一下，楼主做的DC是人还是鼠的？

作者: cj_mondy 时间: 2012-4-9 13:03

最近也做transwell，有几个问题想请教楼主大使一下：
1、我也用的是DEPI染色，下面是200倍下的图片，请问这样照片拍了5个视野之后，如何计算细胞迁移率呢？怎么根据这5个视野计算出迁移过膜的细胞数呢？

2、我做的是药物对肿瘤细胞的干扰，一般情况下，药物什么时候加抑制效果会比较好呢，是预处理在加，还是把药物加入小室中直接观察？

3、药物是加入上室还是下室呢，还是上下室都加比较好呢？

多谢赐教！

图片附件: 11397448.snap.jpg (2012-4-9 13:03, 15.93 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11548

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:03

谢谢楼主回复。
该蛋白是膜蛋白。
如果是直接把表达该蛋白的肿瘤细胞和巨噬细胞或DC细胞共同培养，检测吞噬率当然更直接。老板想让我做transwell.我想很大程度上是想把这一技术在实验室建立起来。
按照假设，在肿瘤细胞表达目的蛋白后，DC或巨噬细胞应该会向肿瘤细胞迁移，如果是这样的话，做transwell中的细胞趋化实验或细胞迁移实验是否合适?或者楼主有没有更好的建议？
另外想问一下，楼主做的DC是人还是鼠的？

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您好。
如果您想把该膜蛋白表达在细胞表面，再做transwell趋化实验，那么您能够完全排除肿瘤细胞表达的其它表面分子或者分泌的蛋白的影响吗？为什么不直接检测该蛋白对于巨噬细胞或者DC的影响呢？

个人做过人和小鼠DC。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:03

ranswell通透性支持物的选择和使用手册下载不了，楼主能否上传一下?麻烦了

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您好。我试了一下，仍然是可以下载的，您可以调调自己的电脑。
或者您把我压缩过的下载一下也行。

作者: sunnyB 时间: 2012-4-9 13:04

在家里和科室的电脑都没下载成功，你上传的我也打不开，估计是没有带压缩分卷的磁盘

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:04

最近也做transwell，有几个问题想请教楼主大使一下：
1、我也用的是DEPI染色，下面是200倍下的图片，请问这样照片拍了5个视野之后，如何计算细胞迁移率呢？怎么根据这5个视野计算出迁移过膜的细胞数呢？

2、我做的是药物对肿瘤细胞的干扰，一般情况下，药物什么时候加抑制效果会比较好呢，是预处理在加，还是把药物加入小室中直接观察？

3、药物是加入上室还是下室呢，还是上下室都加比较好呢？

多谢赐教！

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您好。欢迎您来交流。
1、其实取几个视野计算的都是相对迁移的数目，只要各实验处理组之间有差异即可。悬浮细胞则可以根据掉入下腔的数目计算出绝对迁移细胞数。

2和3，什么时候添加药物，怎么添加药物，要看您的实验设计。个人认为预处理之后做迁移，比较能和其它的因素分的开。
供您参考。

作者: tieshazhang 时间: 2012-4-9 13:06

我们已经做了膜上表达该蛋白的稳转细胞株，需要比较APC对有该蛋白和无该蛋白肿瘤细胞的吞噬区别

作者: whitesheep 时间: 2012-4-9 13:06

我是硕士毕业工作几年刚考上这个实验室的博士，目前刚进实验室，对情况还不是很熟悉。老板让做transwell,在丁香园搜了一下，看到你的帖子写得挺好，就进来了，基础工作没做好，还望见谅

作者: whitesheep 时间: 2012-4-9 13:06

另外楼主做过DC，也想咨询一下，因为未成熟的DC抗原摄取能力最强，我做实验要取这样的DC的话，是不是将小鼠骨髓细胞用细胞因子刺激后取贴壁的细胞就可以了？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:07

我们已经做了膜上表达该蛋白的稳转细胞株，需要比较APC对有该蛋白和无该蛋白肿瘤细胞的吞噬区别

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哦，稳转之后，该细胞趋化因子或者分子的表达情况有无变化，鉴定了没有？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:07

另外楼主做过DC，也想咨询一下，因为未成熟的DC抗原摄取能力最强，我做实验要取这样的DC的话，是不是将小鼠骨髓细胞用细胞因子刺激后取贴壁的细胞就可以了？

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DC在诱导过程中，随着逐渐成熟，其也由贴壁发展为半贴壁乃至悬浮，细胞表面的突起也会逐渐增多变长。
小鼠DC一般是把小鼠骨髓细胞加GM-CSF和IL-4诱导5天左右，收悬浮细胞和半悬浮细胞作为未成熟DC。至于那些firmly attatched的，恐怕还是巨噬细胞或者其它贴壁细胞居多。
当然，这时候收到的DC里面恐怕还掺杂有其它的悬浮细胞，比如T或者B，所以想要精确一些，还要sorting一下比较好。

作者: wmp1234 时间: 2012-4-9 13:08

哦，稳转之后，该细胞趋化因子或者分子的表达情况有无变化，鉴定了没

没有

作者: tianmei001 时间: 2012-4-9 13:08

在做神经干细胞和胶质瘤干细胞的相关实验，很想使用transwell做干细胞球的迁移和侵袭实验；但上级医师说这类成球样聚集生长的细胞不适合使用transwell，查国外文献还是说可以做的。
1.对于聚合成球样成长的干细胞球的transwell趋化实验和侵袭实验，具体操作如何进行？
2.如果这个问题解决了，请楼主也给我提供一下corning公司的联系方式好吗？谢谢

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:08

在做神经干细胞和胶质瘤干细胞的相关实验，很想使用transwell做干细胞球的迁移和侵袭实验；但上级医师说这类成球样聚集生长的细胞不适合使用transwell，查国外文献还是说可以做的。
1.对于聚合成球样成长的干细胞球的transwell趋化实验和侵袭实验，具体操作如何进行？
2.如果这个问题解决了，请楼主也给我提供一下corning公司的联系方式好吗？谢谢

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您好。

如果要对成球样聚集生长的细胞做趋化实验和侵袭实验，应当保证种下去时细胞为单细胞悬液，而且在迁移或者侵袭试验过程中，不会因为增殖分离形成球而影响单个细胞过膜。您可以看看您的细胞的生长周期和需要的迁移时间，评估一下，是否可以进行试验。

corning公司的联系方式我已经PM给您了。

作者: c86v 时间: 2012-4-9 13:09

楼主，您好！
我想问一下3413这个货号，24孔板，里面是24个配套的小室吗？说明书上写的12/plate，不知道什么意思呢，难道里面只有12个配套小室？。
另外我想问一下，我买的3402这个货号（12孔板）做药物转运实验，可以先用其中的几个小室先做实验吗，还是必须一次用呢？
万分感谢楼主抽空解答！

作者: dragonkilly 时间: 2012-4-9 13:09

我现在想订的是Corning(3401)板，它具体参数是小室直径12mm，面积是1.12 cm2,常规应该放在12孔板中，但是其标的是12/24well，也即放于24孔板中，请问这种小室放在24孔板中时，其上下室的加量是上下0.1/0.6ml，还是0.5/1.5ml呢？

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:10

楼主，您好！
我想问一下3413这个货号，24孔板，里面是24个配套的小室吗？说明书上写的12/plate，不知道什么意思呢，难道里面只有12个配套小室？。
另外我想问一下，我买的3402这个货号（12孔板）做药物转运实验，可以先用其中的几个小室先做实验吗，还是必须一次用呢？
万分感谢楼主抽空解答！

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您好。24孔板通常确是12个小室。打开包装后最好用完，如果实在用不完，个人试过把培养板的边缘用胶布贴紧，然后放在负20保存，也可以的。

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:10

我现在想订的是Corning(3401)板，它具体参数是小室直径12mm，面积是1.12 cm2,常规应该放在12孔板中，但是其标的是12/24well，也即放于24孔板中，请问这种小室放在24孔板中时，其上下室的加量是上下0.1/0.6ml，还是0.5/1.5ml呢？

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您好。从它的小室直径和生长面积上来看，应当是适合放在12孔板内的，如果那样推荐的加液量为0.5/1.5ml。不过有时候可以根据实验需要自行掌握加液量，以下层的液体量不高过小室边缘和小室液体量不溢出为上限。

作者: fklo83 时间: 2012-4-9 13:11

您好。24孔板通常确是12个小室。打开包装后最好用完，如果实在用不完，个人试过把培养板的边缘用胶布贴紧，然后放在负20保存，也可以的。

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谢谢！放负20比较好吗？我现在拆开包装还没用，装在铝盒里放在超净台里面，可以吗？另外，培养板铺上鼠尾胶原后能打开盖子在紫外线下过夜杀菌吗？谢谢楼主了：）

作者: 园丁## 时间: 2012-4-9 13:11

谢谢！放负20比较好吗？我现在拆开包装还没用，装在铝盒里放在超净台里面，可以吗？另外，培养板铺上鼠尾胶原后能打开盖子在紫外线下过夜杀菌吗？谢谢楼主了：）

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短期放超净台没问题。紫外杀菌应当也可以。

作者: ritou1985 时间: 2012-4-9 13:12

请教一个问题:能否用5um孔径的Transwell做Caco-2药物吸收实验?
虽然观察到有一些细胞漏到接收孔里去了，但是膜上致密单层还是可以形成的吧？造模能否成功？

作者: mimili_901 时间: 2012-4-9 13:13

请问做Transwell的时候怎样去除细胞增殖的影响?也就是说增殖的细胞是不是不能穿过膜的,只有迁移的细胞才能穿过膜,对吗?

作者: DDD 时间: 2012-4-9 13:13

DAPI是怎么稀释配制的

作者: bohe221 时间: 2012-4-9 13:13

你好！最近试验需要做共培养。是肝细胞和巨噬细胞的共培养，肝细胞为贴壁细胞，巨噬细胞为悬浮细胞，请问在选择什么样的transwell的培养板？选择哪种胶呢？
另外康宁在武汉有没有销售点，联系方式是什么？

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-9 13:14

请问做Transwell的时候怎样去除细胞增殖的影响?也就是说增殖的细胞是不是不能穿过膜的,只有迁移的细胞才能穿过膜,对吗?

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不能消除增殖的影响,所以transwell实验不能够太长时间.

作者: 乌贼老弟 时间: 2012-4-9 13:14

你好！最近试验需要做共培养。是肝细胞和巨噬细胞的共培养，肝细胞为贴壁细胞，巨噬细胞为悬浮细胞，请问在选择什么样的transwell的培养板？选择哪种胶呢？
另外康宁在武汉有没有销售点，联系方式是什么？

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共培养接下来想做什么呢?只需要检测上清还是需要提取某部分细胞的RNA或蛋白?
一般的共培养是用0.4uM的膜,让细胞因子通过而不让细胞通过

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