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标题: [求助]关于激光共聚焦样品的制备 [打印本页]

作者: ququer787 时间: 2012-4-9 14:41 标题: [求助]关于激光共聚焦样品的制备

我是新手，准备做激光共聚焦。请问做过激光共聚焦的朋友们，样品的制备需要注意哪些方面？

作者: hold住 时间: 2012-4-9 14:41

我也想知道，我是把细胞种在支架上，放在什么上看啊？

作者: cj_mondy 时间: 2012-4-9 14:41

我过几天也要做共聚焦了,可是对于样品的处理还是不太知道,查阅书籍也没找到很详细的步骤,希望有经验的高手们给我们一些指点把

作者: shenkunjie 时间: 2012-4-9 14:42

1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了.

2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察.

作者: shenkunjie 时间: 2012-4-9 14:43

补充一以下:
如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了.

作者: pengke1983 时间: 2012-4-9 14:44

需要购买专用的盖玻片和培养皿，一般的盖玻片和培养皿效果不好，薄督导不到要求，小心浪费试剂，染料比较贵

作者: 101010 时间: 2012-4-9 14:44

买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。

作者: yychen 时间: 2012-4-9 14:44

加药设备可自制，用注射器挂高，下面用三通接输液管接针头到浴槽里面。
请问：用什么做浴槽？浴槽中的液体怎样流出？

作者: kuaizige 时间: 2012-4-9 14:45

小心胶水有毒,最好买现成的玻底皿(glass bottom dish),国内有卖的.有进口的和国产的,听说国产的也是用进口玻片,比较便宜啊,洗洗还可以重复使用.

作者: duoduo 时间: 2012-4-9 14:45

对于细胞的激光共聚焦，它的处理和细胞的免疫荧光是一样的。你查一下免疫荧光的实验方法很多的。不过你要注意一下一些细节。
1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。你最好拿弱酸，如稀盐酸浸泡。
2、然后灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片。
3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了。一定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了。
4、在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油或其它胶固定。用锡箔纸报住，避光4c保存，最多一个月。
5、最好染核，核好染，同时也便于观测。
6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦。毕竟激光共聚焦很贵。

作者: c86v 时间: 2012-4-9 14:45

请教啊，做共聚焦反反复复要用PBS洗十几次，怎么样才能染细胞更好的贴在片上，因为我的是悬浮细胞？

作者: guagua 时间: 2012-4-9 14:46

请问有人做过组织切片的共聚焦样品吗？应该如何准备？谢谢

作者: HPLC使者 时间: 2012-4-9 14:46

做的是贴壁细胞的激光共聚焦钙离子浓度检测，是将细胞培养在6孔板里，不知是否不用爬片，直接在显微镜下观测？

作者: is2011 时间: 2012-4-9 14:46

我最近也要做贴壁细胞的激光共聚焦图片，想问一下，我主要是看一下，肿瘤细胞经抗肿瘤药物作用不同时间段的凋亡情况，请问我要用PI ，RNA酶处理细胞，然后用激光共聚焦显微镜观察，可以吗？就是做流氏的试剂。谢谢高手指教！

作者: dog002 时间: 2012-4-9 14:47

我做过confocal，我个人觉得用confocal来看细胞的亚结构非常好。我用的OLYMPUS的FV1000,我看过说明书介绍，confocal可以做离子浓度的测定，但是我没有做过。组织的切片一样可以做confocal,我的一个朋友就是做的组织，方法和做细胞的荧光一样，结果不错。
我当时做的是细胞的免疫荧光，方法和基本的免疫荧光一样，细胞种在载玻片上，60%融合就好，不要长满，因为细胞太多，挤在一起的话，会影响成像。一抗，荧光二抗，依次孵育。我把我毕业论文中的一张图贴上来给大家看看。我做的是双染，一个抗体用的FITC（绿色），是一种微管蛋白；另一个用的是TRITC，是一种结构蛋白。黄色是两种融合的图像，结果发现这两种蛋白结构上共地位。

图片附件: 56525777.snap.jpg (2012-4-9 14:47, 43.46 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11549

作者: dog002 时间: 2012-4-9 14:48

红色，TRITC

图片附件: 61238223.snap.jpg (2012-4-9 14:48, 38.84 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11550

作者: dog002 时间: 2012-4-9 14:48

黄色，融合像。confocal 可以自动运算，形成融合像。

图片附件: 20661005.snap.jpg (2012-4-9 14:48, 60.05 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11551

作者: 8964357 时间: 2012-4-9 14:48

请问楼上的大侠，做confocal来看细胞的亚结构一定要用FITC 染色吗？请问有人用过PI 染色吗？就是用流式的PI RNA酶。用这种染色可以吗？请指教啊啊谢谢啦！！！

作者: dog002 时间: 2012-4-9 14:49

回答楼上的，当然不是非要用FITC啊。我在奥林巴斯总部做confocal的时候，看见墙上贴了一张图，好像有几十种染料都可以做的，发出的颜色是不同的。由于太多，我没看清楚PI是不是可以。你用FITC或罗丹明多好啊，这些是很常用的染料。如果你用很特殊的染料，需要用特殊的滤片的，不知道人家是否有。
我刚查了一下olympus FV1000的网站，没看到染料的问题。可能是我没仔细看。
你自己找找看，是否有你需要的信息。
cuturl('http://www.olympuschina.com/life/product/product_pro_368997.html')
另外，你可以直接联系奥林巴斯德技术支持，人很好的。
希望对你有用。

作者: 00无名指00 时间: 2012-4-9 14:49

请问有人做过组织切片的共聚焦样品吗？应该如何准备？谢谢

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我也想问此问题，敬请高手指点！我们做组织切片可以用激光共聚焦么？如果可以用，对切片和载玻片有什么要求？谢谢！

作者: 00无名指00 时间: 2012-4-9 14:49

刚刚找到的一半的答案如下：
激光共聚焦显微镜的作用主要是以下几个方面：
1 定量荧光测定比如用于细胞骨架装配、细胞黏附行为、凋亡机制，离子通道装配等研究。
2 定量共聚焦图像分析主要是对获得的光学切片进行分析，测定其生物学物理学特性的变化。
3三维重组分析生物结构通过薄层光学切片，经计算机图像处理三维重建
4 动态观察生物结构用合适的荧光探针标记
5 荧光光漂泊技术研究生物膜的扩散，细胞间通讯等
6 荧光共振能量转移技术
7激光细胞显微外科
8 光活化技术
是否要confocal和免疫组化都做要取决于实验的具体检测指标和实验的目的，比如检测核因子等转录因子，静息状态时核因子kb存在于细胞浆，刺激时进入细胞核，这样用激光共聚焦的共定位技术就可以很清楚的指示出来，而免疫组化只能粗略的看出。
组织切片的自发荧光应该是限制了荧光标记技术在这一方面的应用，所以不做任何处理，在荧光显微镜下都可以看到荧光，处理这样的情况一是选用不同的标记荧光尽量避开自发荧光，也有些去除自发荧光的措施，要具体情况具体使用了。
当然不排除有些文章纯粹为了confocal而confocal，其实能用简单的实验说明问题了就不要选用复杂的了，免疫组化的定位显示在发国外论文的时候还是很受重视的。

作者: fqswdzd 时间: 2012-4-9 14:50

我是做植物微管的，有没有做这方面的同胞，希望能得到你们的帮助
请问用什么一抗和什么标记的二抗染下来的效果比较好？

作者: cocacola 时间: 2012-4-9 14:50

我要做荧光双标，用的是活细胞。请问下各位大侠标记细胞膜一般用哪种染料呢？

作者: okhaha 时间: 2012-4-9 14:50

大家好，我想请问一下，我是做蛋白偶联的，现在我有一个偶联物穿膜肽-抗体-微球三联物（液体中），可不可以用confocal来观察其结构（偶联情况），如果可以的话，要如何制作标本？其中穿膜肽标记有egfp，标记二抗还没有买

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