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标题: [求助]肿瘤细胞复苏后的样子，类似脂滴，又似凋亡 [打印本页]

作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:37 标题: [求助]肿瘤细胞复苏后的样子，类似脂滴，又似凋亡

最近复苏了一上皮肿瘤细胞系，原细胞冻存条件为在-80℃下3个月，复苏后细胞2天相差显微镜下观察如附图，其中图1、图2中箭头所示细胞内类似脂滴状的表现，也不知道是不是细胞刚复苏的缘故，细胞内容易产生空泡，甚是费解，遂来请教园里战友！
附图：

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作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:37

附图2

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11637

作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:38

补充培养基情况：K-SFM培养基（含10%FBS，重组人表皮生长因子10ng/ml），Gibco公司。

作者: ending 时间: 2012-4-13 15:39

请问楼主养的是什么肿瘤细胞？我养的子宫内膜癌HEC-1B也经常出现这种情况，有人说是支原体污染，后来向细胞库重新要了一支，可没过多久又出现了这种情况，特别是传了3-4代之后就出现了

作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:39

请问楼主养的是什么肿瘤细胞？我养的子宫内膜癌HEC-1B也经常出现这种情况，有人说是支原体污染，后来向细胞库重新要了一支，可没过多久又出现了这种情况，特别是传了3-4代之后就出现了

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口腔鳞癌细胞，我的是复苏后出现的，传代后未见类似情况。

作者: xevin 时间: 2012-4-13 15:41

感觉是存放时间太久，细胞活力降低。细胞最好还是保存在液氮里面啊

作者: 3648755 时间: 2012-4-13 15:41

DMSO质量较差，还有种情况是复苏时间过长

作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:43

DMSO质量较差，还有种情况是复苏时间过长

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请问“DMSO质量较差，还有种情况是复苏时间过长”具体怎么解释？

作者: idea2011 时间: 2012-4-13 15:44

DMSO质量差主要表现在纯度不够，你比较一下SIGMA的和国产一些小厂的，冻存细胞的效果是不一样的。
我们知道，细胞的复苏的时间越短越好，其实和冻存的时候正好是反着来的，冻存使得DMSO慢慢渗透，内外达到一个平衡状态，细胞不会死掉，此时的温度很关键，DMSO在此时基本上可认为无毒或者对细胞的毒性很小，但是复苏的时候如果还是这样，细胞膜在37°的水温中DMSO的毒性会显现，对细胞的损伤较大，你这种情况我个人感觉不外乎是这两种情况。
个人经验，仅供参考！

作者: 969 时间: 2012-4-13 15:44

冻存和复苏效果不好。

作者: windy+++ 时间: 2012-4-13 15:45

支原体污染或细胞分化或细胞老化都可能出现这样的现象，这样的细胞是不会增殖的。
有时候细胞刚复苏或生长条件不太适合的时候，容易出现，不过我个人认为没必要做什么特别
的调整，如果你所有细胞都这样那是有问题了，我推测你镜下这样的细胞不会多与5%，等细胞
多长几代，生长旺盛的时候这种细胞就少了。

作者: 831226 时间: 2012-4-13 15:45

细胞膜在37°的水温中DMSO的毒性会显现，对细胞的损伤较大

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请问：复苏的时候不是放到37度迅速溶解吗？
如果“细胞膜在37°的水温中DMSO的毒性会显现”是不是放到37度复苏是错误的了呢？

作者: tianmei001 时间: 2012-4-13 15:46

请问：复苏的时候不是放到37度迅速溶解吗？
如果“细胞膜在37°的水温中DMSO的毒性会显现”是不是放到37度复苏是错误的了呢？

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所以是缓冻快溶。

作者: one 时间: 2012-4-13 15:46

群里有战友说，冻存的时候在-20度不要超过半小时，可是我们实验室的protocol却是-20度2个小时！！请问各位战友是不是这样做对细胞很不好？
还有一个问题是，网上很多有关复苏细胞的方法中都提到了37度复苏，1分钟内完全融化，可是我在实际操作中，一般1分钟很难彻底融化（复苏时不断摇晃）。这个会影响到细胞的状态吗？因为自己的细胞总是赖赖洋洋的不健康。请各位战友多传经验！

作者: ha111 时间: 2012-4-13 15:49

复苏的时候还是把水浴温度调到40度吧。

作者: ha111 时间: 2012-4-13 15:51

-20冻过夜也能复苏出来，一般的-20一个小时吧，如果有异丙醇的冻存罐也行，还有些商品化
的冻存液也可以用（悬起细胞后直接放-80，不需要任何保护，复苏效果非常好，价格有点小贵）。
至于复苏，个人推荐把水浴温度调到39-40度，不断摇晃的话，局部温度还是很低的，这样溶的快，能到1min左右。

作者: bamboo16 时间: 2012-4-13 15:51

补充说明：
复苏细胞前在超净台里准备好培养液和离心管，以便冻存的细胞溶解后迅速能转移带离心管并快速加入培养基离心，细胞从-80℃冰箱拿出来迅速在37℃水浴箱里来回晃动融化，约1分钟完全溶解。由于复苏的细胞出现类似图片中的“空泡”，而在复苏后第一次传代的细胞中大大减少类似的“空泡”细胞，再加上之前细胞在-80℃冻存大约5个月，所以本人觉得还是细胞生长不良所致，本人推测可能是细胞器的“坏变”所致。
再补充理由：复苏的细胞需1周才能长满瓶底，传代的细胞3天即可。

作者: TAT 时间: 2012-4-13 15:52

冻细胞的时候为什么要缓慢冻呢？为啥呢？

作者: guagua 时间: 2012-4-13 15:54

避免胞内出现冰晶，而伤害细胞。

作者: join 时间: 2012-4-13 15:54

缓冻前面已经解释了，速溶是因为在细胞处于-50度这一温度点时对细胞伤害最厉害，所以要尽可能快地通过这一时间点，当然温度较高时DMSO(>1%)对细胞是有损害的，所以要速溶。

作者: 911 时间: 2012-4-13 15:56

我们实验室里的细胞冻存是现在4度半小时，然后-70°24h之后马上放到液氮中保存。细胞复苏是在37°，不过我一般会让温度到39度这样时间可以在1min内溶。养细胞的情况来看，还是比较好用的。

作者: woshituzhu 时间: 2012-4-13 15:56

是不是脂滴用油红染色看就清楚了，我觉得不是脂滴，而是空泡。

作者: tianmei001 时间: 2012-4-13 15:57

学习学习
我们现在都不是水浴的，直接用手撰着，很快就溶解了

作者: redbutterfly 时间: 2012-4-13 15:57

我的细胞就算不是刚复苏，在培养的过程中也会有这样的情况，老师们也没有统一的说法，就是说老化了

作者: loli 时间: 2012-4-13 15:58

我的细胞就算不是刚复苏，在培养的过程中也会有这样的情况，老师们也没有统一的说法，就是说老化了

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有两个原因：
1、细胞在你复苏之后就一直培养造成代数过长在一定时间之后会出现细胞比较“懒”具体就是细胞长得很慢基本不分裂慢慢的就出现胞内大量空泡的样子。

对于这种情况的解决办法是重新复苏新的一管细胞注意掌握慢冻快融原则

2、是由于细胞营养不良所致具体是由于细胞培养液一直都是在同一个瓶子里配制的旧的快用完了新的培养液还继续往同一个瓶子里配最后就会导致细胞培养液体系发生一些变化

建议一段时间之后就换成新的培养瓶来配置培养液

或者也可以尝试着在原培养液里加一点非必需氨基酸non essential amino acid（Gibco），效果会有所改善。

另一个对于这种营养不良所致细胞空泡的解决方案是给细胞传传代随着状态比较好的细胞的生长那些状态不好的细胞会慢慢少去的

祝实验顺利！

作者: jujuba 时间: 2012-4-13 15:59

有可能是自噬。
细胞饥饿的时候能够引发自噬。如果细胞在较低的温度下保存太长时间，再加上刚刚复苏后，细胞的状态不好，可能会发生这种现象。

作者: jujuba 时间: 2012-4-13 15:59

附件是细胞自噬的电镜照片：

希望大家指正。

图片附件: 17960553.snap.jpg (2012-4-13 15:59, 98.64 KB) / 该附件被下载次数 0
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作者: jujuba 时间: 2012-4-13 15:59

附件是细胞自噬的电镜照片：

希望大家指正。

图片附件: 19883780.snap.jpg (2012-4-13 15:59, 98.64 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11639

作者: remenb 时间: 2012-4-13 16:00

细胞状态不是很好，但是可以看到还是有一些细胞是可以的，LZ可以继续培养，最好消化离心下，如果没污染的话应该是可以长起来的！

作者: sunnyB 时间: 2012-4-13 16:01

我以前也碰到过这样的问题，但我后来用不含DMSO的冻存液，就不怕这样的情况了，同时37度的水浴温度不行就可以开到40度，还有1分钟内还没有完全融化，那就再过一会。看个人手法的。

作者: 49888 时间: 2012-4-13 16:02

补充说明：
复苏细胞前在超净台里准备好培养液和离心管，以便冻存的细胞溶解后迅速能转移带离心管并快速加入培养基离心，细胞从-80℃冰箱拿出来迅速在37℃水浴箱里来回晃动融化，约1分钟完全溶解。由于复苏的细胞出现类似图片中的“空泡”，而在复苏后第一次传代的细胞中大大减少类似的“空泡”细胞，再加上之前细胞在-80℃冻存大约5个月，所以本人觉得还是细胞生长不良所致，本人推测可能是细胞器的“坏变”所致。
再补充理由：复苏的细胞需1周才能长满瓶底，传代的细胞3天即可。

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不同意见：复苏的细胞潜伏与倍增时间要看哪种细胞及用哪种培养液。我用DMEM/F12K养的结肠癌细胞复苏过夜就完成潜伏，进入倍增阶段即对数生长期。复苏细胞占25厘米方瓶的50%，24小时就长到80-90%。

作者: wsll 时间: 2012-4-13 16:02

照片很漂亮

作者: abc816 时间: 2012-4-13 16:02

我养的成骨细胞，前天晚上复苏的，昨天就长满了传代了，长的非常好

作者: skytree 时间: 2012-4-13 16:03

听说在-80℃冰箱不能存放细胞时间过长，有一个原因就是冰箱有时会被经常开关，冰箱内温度有可能骤升，这样对细胞很不利，复苏后的成活率也不高

作者: xevin 时间: 2012-4-13 16:04

其实冻细胞非要有DMSO吗？非要慢慢的冻吗？不见得呵呵

作者: S6044 时间: 2012-4-13 16:04

你的细胞在-80度保存3个月后复苏，可能会存在你目前细胞复苏的状态，这种细胞就是你描述的细胞已经凋亡。细胞冻存在-80度保存最好不要超过1个月，最佳的保存应放置液氮

作者: yueban-1147 时间: 2012-4-13 16:05

学习学习
我们现在都不是水浴的，直接用手撰着，很快就溶解了

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同学，那是从液氮里拿出来的啊，你的手掌皮真厚

作者: 阿敏 时间: 2012-4-13 16:05

呵呵，楼上的真逗。

我们液氮都放满了，我没地方放细胞了。只能放到-80度。

作者: dotaaa 时间: 2012-4-13 16:06

学习学习
我们现在都不是水浴的，直接用手撰着，很快就溶解了

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你当是母鸡孵蛋呢，还用手攒着，-80度拿出来的啊，老兄~~

作者: ladyhuahua 时间: 2012-4-13 16:06

楼上的试一试就知道了，我们实验室也是从-80度拿出来后直接用手握紧，然后吸培养液吹打，半分钟就足够了。这样复苏细胞已经很多年了。没有一点问题。大家可以试试。

作者: vcve 时间: 2012-4-13 16:06

我前两天也这样做的，怎么我的细胞全死了？

作者: 2541 时间: 2012-4-13 16:07

我觉得照片里的细胞就是状态不好，要死了。好好养没什么大事。
还有融细胞的时候超过1分钟的情况，我的感觉是不同的冻存液可能也有影响。我有些其他来源的细胞同样情况融化，速度差别也很大，有些半分钟就行了。我想这只能归结于冻存液成分问题了，因为冻存液配方还是因人而异，差别很大的。

作者: 66+77 时间: 2012-4-13 16:08

请教各位大侠，转染细胞的上清进行电镜扫描需要做什么处理？谢谢啊

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