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标题: [求助]免疫荧光双标 [打印本页]

作者: 北风那个吹 时间: 2012-4-14 14:36 标题: [求助]免疫荧光双标

最近我发了一篇文章，做某一个基因在细胞膜中的表达，用细胞免疫荧光方法，但审稿人问为何不用免疫荧光双标呢？不知单标和双标有何区别。谢谢！！

作者: one 时间: 2012-4-14 14:37

我也想做这一块。不知审稿人的意思是不是既要标记细胞膜又要标记基因？

作者: TAT 时间: 2012-4-14 14:37

你好！我想咨询一一个问题！我最近也想用荧光标记蛋白质，我想问一下，你是用的试剂盒标记的？如果用的试剂盒的话，厂家是哪个？货号？还是直接用的免疫荧光染料？
新手！请多多照顾！

作者: loli 时间: 2012-4-14 14:43

最近我发了一篇文章，做某一个基因在细胞膜中的表达，用细胞免疫荧光方法，但审稿人问为何不用免疫荧光双标呢？不知单标和双标有何区别。谢谢！！

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做一个基因的表达，一般都是做单标吧，只有做两个不同基因的时候才分别用不同的荧光抗体标记，以示区别。
顾名思义，单标就是一个抗体标记，双标是两个不同抗体标记不同基因，从而观察两个基因的表达，定位等等~~~~

作者: 2541 时间: 2012-4-14 14:44

同意楼上，叫做免疫荧光共定位

作者: 北风那个吹 时间: 2012-4-14 14:45

这是审稿人的意见
Analyzing the subcellular localization of proteins generally requires co-localization with accepted markers and/or confocal imaging.

作者: kswl870 时间: 2012-4-14 14:46

这是审稿人的意见
Analyzing the subcellular localization of proteins generally requires co-localization with accepted markers and/or confocal imaging.

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他的意思是说，你要给个膜蛋白的marker。这个你要查查看，那种染料是专门染膜蛋白的。
要证明一个蛋白定位在膜上需要严谨的证明。
比如说可以分膜蛋白和包浆蛋白提取，wb证明只在膜fracion中有你的蛋白，而cytoplamic中没有。还可以用surface biotion方法，提取膜蛋白，再杂你的目标蛋白。再有就是用你的免疫荧光的方法。但你这个方法要注意你的抗体是针对蛋白的哪部分的，这部分是在胞外呢，还是在胞内呢，还是跨膜区，这样出来的结果都是不同的。最好是表达一个N端和C端都带不同tag,比如myc,his ,用这些抗体做，会比较好。还有就是做IP了，抗体直接和living cell 孵育（不裂解细胞），再拉，如果能拉下来，就是膜上了。
随便说说啊。瞎出点主意。哈哈。

作者: idea2011 时间: 2012-4-14 14:50

这是审稿人的意见
Analyzing the subcellular localization of proteins generally requires co-localization with accepted markers and/or confocal imaging.

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你是否只用普通荧光显微镜拍了？人家不是说了吗，有共聚焦就行，大不了再用DIO或DIL染下细胞膜，再上共聚焦，证据已经很充足了。很简单的，碧云天有试剂。提细胞膜很麻烦！

作者: idea2011 时间: 2012-4-14 14:51

补充一句，DIL和DIO都是染双层磷脂膜的，一个发红色荧光一个绿色荧光，现染现拍，荧光很强，也便宜。再好点就用MP的细胞膜探针，拍摄时间窗口长很多，但也巨贵

作者: eric930 时间: 2012-4-14 14:52

他的意思是说，你要给个膜蛋白的marker。这个你要查查看，那种染料是专门染膜蛋白的。
要证明一个蛋白定位在膜上需要严谨的证明。
比如说可以分膜蛋白和包浆蛋白提取，wb证明只在膜fracion中有你的蛋白，而cytoplamic中没有。还可以用surface biotion方法，提取膜蛋白，再杂你的目标蛋白。再有就是用你的免疫荧光的方法。但你这个方法要注意你的抗体是针对蛋白的哪部分的，这部分是在胞外呢，还是在胞内呢，还是跨膜区，这样出来的结果都是不同的。最好是表达一个N端和C端都带不同tag,比如myc,his ,用这些抗体做，会比较好。还有就是做IP了，抗体直接和living cell 孵育（不裂解细胞），再拉，如果能拉下来，就是膜上了。
随便说说啊。瞎出点主意。哈哈。

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正解

作者: 北风那个吹 时间: 2012-4-14 14:54

DIL和DIO是不是细胞膜上的特异性染色呢？

作者: 3648755 时间: 2012-4-14 14:54

还可以用FITC－VVA（vicia vilosa agglutinin),染整个膜上的糖蛋白。

作者: vera+ 时间: 2012-4-14 14:54

我也做了一个膜蛋白，细胞破碎后，超速离心，取膜成分和cytosol fraction进行SDS-PAGE，就粗略看到，再用其他方法验证。

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