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标题: [讨论帖]“细胞培养心得 [打印本页]

作者: ritou1985 时间: 2012-4-16 12:52 标题: [讨论帖]“细胞培养心得

养细胞有3年了吧，虽然最近不用我接手了。从一开始跟师傅学，到最后有了自己的养细胞方法，经历很多挫折，也收获了把细胞养好的喜悦，
从做徒弟开始，可以很荣幸的说，到现在从没又把细胞污染过，从悬浮，贴壁，半贴壁。最后总结出一句话“养细胞就跟养孩子一样”，你不用心传的话，两天就会长得乱七八糟。记得一开始做鸡纤维细胞，两个鸡胚铺的细胞都长不满，做试验根本没法做，好歹连续做了两个周，才掌握了方法，板底铺的正好。
细胞做多了，他也就熟悉你的脾性，你也就熟悉他的脾性了，嘿。。。还是那句话“养细胞要跟养孩子一样”O(∩_∩)O哈！

作者: 33号 时间: 2012-4-16 12:54

记得养细胞是在5年前，经常要换液，我的一个师兄忙毕业论文，我这个人也是闲着没事干，就接下了这个任务。因为每次细胞出现不贴壁，就打电话给师兄来处理。
后来到一家公司，我们也进行细胞培养。主要进行一个产品的活力测定。由于这个产品在市场上基本是独家销售，利润空间很大。但是出于其他方面的考虑，生产的批次还是较少的，活力测定很少测定，后来药检所要抽样检验。当时药检所也没有专门的细胞活力测定的实验室，所以就要到我们公司进行试验。
于是试验就在公司开展，由于这边基本上不做这个实验，买耗材和试剂成了一个很大的麻烦，因为很多试剂代理商看到这些实际量少以及种类较多，基本上都是回绝了。郁闷，但是在我原来的实验室通过关系“免费赞助”了一批。试验终于开展起来了。
试验终于开展起来了，药检所来了一个漂亮妹妹来监督试验，晕！她不做实验，而是监督。由于刚开始做，首先是细胞的解冻接种培养，不是不贴壁，就是不生长，郁闷！她也鼓励我们说细胞培养是很难，她曾经在学校培养了半年的细胞才最后进行试验的，她主要是培养神经细胞的。后来向师兄打听，说神经细胞是很难培养的。也就是说她是一个高手啊！
既然有高手，就有压力以及有一个好的老师在旁边。试验开展到最后活力测定了。在试验最后一步，看到细胞染色的情况，真是让我冷汗差一点出来了。后来进行酶标仪读数时看到有一些数字和空白值一样，真是悬啊！如果试验失败那就是公司要召回产品，损失惨重啊！随着扫描读数结束，心终于落地了，试验结果很好！那个药监局妹妹说我们操作很好！
我们的产品最好终于放行了，老板也没有提出奖励，感觉是应该的。接着我们继续剩勇追穷寇进行了其他品种的细胞活力测定，并着重进行培训。现在细胞培养几个人终于可以很熟练的操作了。

作者: caihong 时间: 2012-4-16 12:54

细胞培养做了很多年，遇到最多的麻烦就是长菌。
个人体会：
1.见好就收
如果细胞状态好，赶紧冻存一批。当出现污染或细胞长得不好时，可以重新复苏细胞，从头再来。
2.时刻保持低调
细胞出现污染往往在自我感觉越来越好的时候，千万不要骄傲。认认真真做好每一天的工作。
3.细节决定成败
细胞培养的每一个环节出现问题都有可能影响到细胞的生长，不能放松。

作者: lixi559 时间: 2012-4-16 12:55

痛并快乐的养了好几年细胞了，污染数不胜数啊～
我养的细胞污染过：霉菌—长得像朵蒲公英，漂亮啊~~可惜长在了我得培养皿里。
放线菌：有很长的丝，是放线菌吧？
细菌：细细黑黑的，还会游动，一天就长满了。好恶心
不知道什么的菌: 黑色的流沙状的，好象我还在这儿问过。
大部分情况下，污染了赶紧扔，别影响其他细胞就行。污染主要是操作的问题，如果担心培养液有问题，可以取一点放在新的35mm小皿里，在培养箱放一天看看。或者１：１加ＬＢ培养基，３７度摇床过夜检测。
霉菌我试过挽救，挑出去换液，不过没去干净，第二天四处开花，只好扔了。
流沙状的那种污染，我用PBS洗了好多遍,种在96孔板里，长是长起来了，快长满6孔板的时候突然又满孔流沙淹没细胞了。看来，这个方法也没用，以后可以直接仍了。
总之，污染之后挽救，远如不操作的时候小心，需要的东西在超净台里准备好照上，总拿进拿出容易把外面空气里的菌带进去。还有东西位置规划好，别把袖子在需要无菌的东西上面晃来晃去。

作者: glass 时间: 2012-4-16 12:56

细胞真是个头疼的玩意~~当初是为了帮师姐的忙，才进的实验室。对分子生物一点不感兴趣，却喜欢上了培养细胞，可是这确实最大的考验。
细胞培养的前期工作很长，小鼠，培养基，灭菌......实验进行也只是短短的几小时，可是花费在前期工作的时间确实无法计算的。当一切准备就绪，也可能一点的疏忽让所有的细胞无法生长~~~
当初冻存小鼠成纤维细胞实验已经成型，可是有一天开始突然复苏细胞的生长状态很不好，我寻找了一年的时间改进方法，终于把冻存液配方以及冷冻程序改良后才恢复原来的状态。这里也把我的冷冻方法告诉大家一下吧：胎牛血清：DMSO=9：1,四度冷冻30min，-20度冷冻1小时，转到-70度，过夜第二天存入液氮中。也可以选择程序冷冻盒，但是感觉没有这个效果好呢。
记得有几个月我培养的细胞都没有菌生长，实验室其他人的细胞都不同程度的长菌，而且他们长菌的细胞给我，我也能挽救回来。就这样自己就飘飘然了，和老师夸口说自己养细胞从来没长过菌。可仅仅是第二天，和同学喝的迷糊的就去做实验了，自己感觉喝的还不算多，可是手却发抖了。果然可怜的293GP就被我弄得不像胞样了~~全是菌样~~哈哈！
细胞这个孩子还得住的好地方~~我们实验室以前一直用一个红色盖子的培养瓶，7元一个，也不便宜~~可是后来用了一个蓝色BD的培养瓶，这些细胞就喜欢上BD的了~再用以前红色培养瓶就不好养了，真是奇怪~~有时候用BD的瓶子装点胎牛血清，可是感觉那个瓶子是不是太好了，可能有透气性，喷喷酒精就发现血清颜色不正常了~~弄得细胞很久都吃不好~唉！
有的时候为了避免长菌，自己就使劲往手上喷酒精，然后再戴手套再喷，可是又一次竟然用了工业酒精，杂质超多，弄得手感觉火辣辣的难受~~唉，也没有工伤钱，可怜的细胞人！
就是这样的我们成就了中国的生物产业~就是这样的我们才能让BOSS发出SCI，不知道什么时候才是我们这样人的天下，愿所有养细胞的人都能顺利，不长菌，满贴壁，形态好，多发SCI!!

作者: greenbee 时间: 2012-4-16 12:57

我养细胞也两年多了，刚开始的时候很痛苦，啥也不会，很多东西都没有见过，很迷茫，没开始一个新实验都要紧张好几天。在这种情况下，在实验之前往往需要查阅大量的资料。对整个实验的原理，操作细节都要在头脑里反复演练几遍。在过去的两年中，我基本都是这样过来的。以我养EPC的经历为例，什么时候第一次细胞换液？针对这个问题，我看了很多文献，各个文献的说法很多不一样，从中我了解了EPC换液的一些情况，然后有了一些自己的经验。同样，关于单个核细胞的接种密度的问题，我也是查了很多的资料，最后才有了自己的经验。我的实验也取得了成功。那是相当的喜悦！------准备要充分！

当然，我也有失败的时候。有一次，自己想偷懒，将原代培养-传代培养-细胞换液同时做了，当时超净台上也是一团糟，结果那批细胞全部给污染了，直接的结果就是2个月的劳动全部白费了。当时实在是太郁闷了！那次的教训告诉我，就是实验一定要注意细节，不要心急！--要有耐心，要注意细节！

要多听听别人的意见，但是别人的意见不一定正确，要自己摸索和思考，要多阅读！

作者: 一叶 时间: 2012-4-16 12:57

我进实验室的第一件事就是进行的细胞培养，到目前为止，已经8个年头了。中间确实经历了坎坷和喜悦。要知道，如果你的细胞成为大家参观和崇拜、学习的对象，那是多么自豪的一件事。
下面将我这几年来样细胞的经历和感想跟大家交流一下。
1、启蒙老师的重要性。父母是人生的第一/最好导师，说明了启蒙老师的重要性，尤其是在孩子的教育上。细胞培养也是如此。一般进实验室都有师兄带着做，师兄就是你做细胞的启蒙老师。他的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则，如营养液、细胞瓶的摆放位置；灭菌处理程序；开盖手法；细胞吹打手法等等。俗话说，名师出高徒，强将手下无弱兵，就是这个道理。第一次最重要！
2、永恒的细心和耐心。开始做细胞，在师兄的带领下，一般在细节上都很注意，细胞一般也长的不错。然后就有点飘飘然，自认为不也就这么容易嘛。然后就会放松警惕和要求，后果马上就会出来了。轻则细胞状态不好，重则细胞污染，营养液污染。
3、好细胞要及时保种。刚开始做细胞，有些问题不是很懂。有一次，老板从别处拿来一瓶细胞，让我培养。状态非常好，我就一直传代，都有十几瓶了，后来由于失误，结果全部细胞都污染了。结果可想而知——一顿很批。也许早问一下，早冻存也不会出现这种情况。还有当时嫌麻烦，老板说过多次，细胞要分批传代，这样即使有一批出了问题，还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。尤其实验室超净台紧张、利用率高的情况下。
4、特殊情况下更需注意。细胞培养时间长了，人总会有点自以为是，飘飘然。有一次，晚上那个喝了点酒，因为第二天要转染，所以，晚上要把细胞传代一下。自以为没事，传个细胞还不容易。结果第二天就污染了。就像前面战友提到的情况。当时多亏还有其他没有传代的细胞。
5、每种细胞都有自己的特性，要区别对待。细胞跟人一样，不同的细胞，培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。如高糖/低糖DMEM、胎牛血清、新生牛血清、马血清、含/无丙酮酸钠、RPMI-1640等。
6、培养前的工作准备充分。包括耗材的处理、试剂的配置，无菌检验等等。
（1）玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿（细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干净（注意死角），然后冲干净。用酸液浸泡24h以上，之后用清水冲洗10遍，除去残留酸液。瓶子之类，冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡24h。晾干后包扎，160度干烤2h待用。
（2）试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意pH值的调节。
（3）无菌检验。主要采用过滤除菌：如胰酶、抗生素、G-418溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌：如PBS、D-Hank's等。
7、试剂分装保存。包括营养液、胰酶、血清等。
血清特别重要。血清必须贮存于–20℃，如果一次无法用完一瓶，可将40～50ml 分装于无菌酸处理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。
一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。（一般情况下不影响细胞培养）
瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到56度后，将血清放入，待温度升高到56度后计时，一般5分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清（包括不同批次）对细胞的影响。
8、细节决定成败。实验进行前，超净台以紫外灯照射30分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
9、注意安全。包括泡酸处理，超净台的酒精灯、打火机。
10、多问、多看、多思考、多改进、多总结。

作者: 831226 时间: 2012-4-16 12:58

细胞培养做了很多年，遇到最多的麻烦就是长菌。
个人体会：
1.见好就收
如果细胞状态好，赶紧冻存一批。当出现污染或细胞长得不好时，可以重新复苏细胞，从头再来。
2.时刻保持低调
细胞出现污染往往在自我感觉越来越好的时候，千万不要骄傲。认认真真做好每一天的工作。
3.细节决定成败
细胞培养的每一个环节出现问题都有可能影响到细胞的生长，不能放松。

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说得好

作者: kulee 时间: 2012-4-16 12:58

我养细胞已经4年了，现在还在养！
刚进实验室的时候，连枪都不会用，打电话问师姐，现在想想很好笑！
我的经验是，养细胞非常需要经验！
首先是培养液，尤为关键，吃的不好，细胞是不会长好的！所以不要在这方面省钱，GIBCO的血清和瓶装培养液还是不错的，这么多年一直用它；
其次是培养瓶和培养板，个人觉得CONING的还不错！
细胞这东西，要大胆而心细，需要每天想着它，但也要给它时间，我们要耐得住性子，平和心态。只要坐在超净台前，就要一切准备工作就绪，绝不能手忙脚乱，尤其在原代培养时，而且建议一次只做一种细胞株的原代培养。（我曾经一次做了9只猪胎儿的成纤维细胞培养，累的半死，只活2只猪的，其余的都污染）细胞冻存之前，一定要预留培养，避免发生冻存失败而前功尽弃。

作者: sunnyB 时间: 2012-4-16 12:59

说起养细胞，我还只是个新手，到现在10个月了，养过PC12和SP2/0，相对来说还是好养的。
养细胞最重要的就是请教经验~不是网上查查的方法马上就可以用上的，总是尝试许久，得到适合自身实验室的条件的方法才能成的，所以养细胞的苦楚，只有我们这些细胞人才体会的到~~

细心是最最重要的，污染往往就是一个不留神~另外千万不要抱侥幸心理，如果可以，尽量多换枪头，换玻璃管什么的，一但有问题，后果很严重~

最后祝所有养细胞的朋友们顺利！

作者: milkdog 时间: 2012-4-16 12:59

养细胞的时间不算很长，如果把时间一分为二的话，可以说前一半时间是在养，机械的操作，后一半时间是在学习，在查找中思考，在思考中进步！

前一半时间，只是根据前人的经验，比葫芦画瓢的配液、配酶、养细胞、标细胞、种细胞、鉴定细胞……，不敢去或者没有时间去怀疑，毕竟刚开始接触实验，一切都是新的，想把每一个问题都搞清楚，而要学的东西太多太多了，作为一个追求完美的人，我迷失了自己，在焦虑中煎熬，而此时养细胞又有人教，也就没有深究。

直到有一天我发现前人的过滤器使用方法压根就不对头的时候，而实验依然在继续的时候，我突然醒悟，以前自己太急了，而做实验又是不能急的一件事，需要去思考，需要去准备，充分的准备，尽可能的思考每一个步骤，每一个细节。而这时，时间已经过去了大半，没有毕业答辩也在情理之中了。

于是，痛定思痛，一切从头再来。

酶的作用是什么，胰酶的作用是什么，胶原酶的作用什么，为什么用1型不用3型，为什么加入透明质酸酶，为什么混匀细胞的时候要十字交叉的摇而不是顺时针或者逆时针摇，为什么要放入培养箱的时候要拧松瓶口，而拿出时要拧紧，为什么孵育箱要加水，加什么水，怎么样加，多长时间加一次，每次加多少，为什么要用co2培养箱，而且浓度还必须是5%，为什么小滤器使用前后要检漏，最多一次能虑多少，针式的还要看保质期，为什么选择dmem-f12培养基，而不选dmem或者1640或其他的，为什么选择无噬菌体的胎牛血清而不选择无支原体的，为什么选择而不选择新生牛或小牛呢？为什么自己的血清要灭火，而他人的不需要呢？为什么抗体分装的时候最少要10ul，为什么多聚甲醛固定的组织要抗原修复，而丙酮固定的就不需要，但同样是多聚甲醛固定的组织为什么石蜡的需要修复，而爬片却不需要修复呢，为什么血清在灭火之前要经历从-20到4度到室温再到37度水域呢，为什么要分装血清呢，为什么这个二抗需要用血清进行封闭而pv9005就不需要呢，为什么要用二抗来源的血清封闭，其他来源的行不行……，太多太多的为什么，也知道不能每一个都解决，那就尽可能尽自己最大的努力去准备，知道试验不得不开始，因为世上没有完美的事情！

直到今天，我又准备了快3个月了，但是仍然觉得不充分，实验还没有开始，不能再拖了，下周一定开始养细胞！

衷心的告诫养细胞的新手们，要思考，要讨论，要问为什么，思考和讨论是一个科研工作者必须要学会的事情，虽然不可能每一个想到的为什么都会有答案，但是尽力就行了。

我的座右铭：不求尽如人意，但求无愧于心，但是要真的是无愧于心。

和大家共勉！！

作者: october7 时间: 2012-4-16 13:00

养细胞的时间不算很长，如果把时间一分为二的话，可以说前一半时间是在养，机械的操作，后一半时间是在学习，在查找中思考，在思考中进步！

前一半时间，只是根据前人的经验，比葫芦画瓢的配液、配酶、养细胞、标细胞、种细胞、鉴定细胞……，不敢去或者没有时间去怀疑，毕竟刚开始接触实验，一切都是新的，想把每一个问题都搞清楚，而要学的东西太多太多了，作为一个追求完美的人，我迷失了自己，在焦虑中煎熬，而此时养细胞又有人教，也就没有深究。

直到有一天我发现前人的过滤器使用方法压根就不对头的时候，而实验依然在继续的时候，我突然醒悟，以前自己太急了，而做实验又是不能急的一件事，需要去思考，需要去准备，充分的准备，尽可能的思考每一个步骤，每一个细节。而这时，时间已经过去了大半，没有毕业答辩也在情理之中了。

于是，痛定思痛，一切从头再来。

酶的作用是什么，胰酶的作用是什么，胶原酶的作用什么，为什么用1型不用3型，为什么加入透明质酸酶，为什么混匀细胞的时候要十字交叉的摇而不是顺时针或者逆时针摇，为什么要放入培养箱的时候要拧松瓶口，而拿出时要拧紧，为什么孵育箱要加水，加什么水，怎么样加，多长时间加一次，每次加多少，为什么要用co2培养箱，而且浓度还必须是5%，为什么小滤器使用前后要检漏，最多一次能虑多少，针式的还要看保质期，为什么选择dmem-f12培养基，而不选dmem或者1640或其他的，为什么选择无噬菌体的胎牛血清而不选择无支原体的，为什么选择而不选择新生牛或小牛呢？为什么自己的血清要灭火，而他人的不需要呢？为什么抗体分装的时候最少要10ul，为什么多聚甲醛固定的组织要抗原修复，而丙酮固定的就不需要，但同样是多聚甲醛固定的组织为什么石蜡的需要修复，而爬片却不需要修复呢，为什么血清在灭火之前要经历从-20到4度到室温再到37度水域呢，为什么要分装血清呢，为什么这个二抗需要用血清进行封闭而pv9005就不需要呢，为什么要用二抗来源的血清封闭，其他来源的行不行……，太多太多的为什么，也知道不能每一个都解决，那就尽可能尽自己最大的努力去准备，知道试验不得不开始，因为世上没有完美的事情！

直到今天，我又准备了快3个月了，但是仍然觉得不充分，实验还没有开始，不能再拖了，下周一定开始养细胞！

衷心的告诫养细胞的新手们，要思考，要讨论，要问为什么，思考和讨论是一个科研工作者必须要学会的事情，虽然不可能每一个想到的为什么都会有答案，但是尽力就行了。

我的座右铭：不求尽如人意，但求无愧于心，但是要真的是无愧于心。

和大家共勉！！

被你的为什么完全弄晕了。。。基本都不大知道。。。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-4-16 13:01

我养细胞还是新手，经历也比较痛苦
前段时间帮师姐养K562细胞，结果长虫了，一下丢了12皿。心都碎啦。
最近自己的实验要养K562细胞，结果细胞状态不好，背景不干净。丢掉了。这下真像丢了自己的孩子，一整天都魂不守舍。我可就这么一皿啊。
我想都是自己操作不行，从头跟师姐学起，会有快乐的一天的

作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:01

细胞计数与存活测试
1. 原理：
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，
其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方
盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计
数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞
数目。
1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细
胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细
胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 材料：
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 计数器(counter)
2.5. 低倍倒立显微镜
2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步骤：
3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于
1.5ml 小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于
100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin
bluish)。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue
等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线
上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细
胞。
3.5. 范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan
blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之
细胞数目。
活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59
死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
贴壁细胞传代-消化过程图示
贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为（以下操作均按无菌操作的要求进行）：
将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；
加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；
一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；

作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:02

视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。
这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验，以轻吹或加培养液后轻摇可下较好，但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。（所用细胞为CHO贴壁细胞，培养基为含10％小牛血清的DMEM-F12，倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。）
取细胞冻存管一支，于40°C水中速融；25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml，将冻存管中细胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液，更换10ml培养基，同上静置培养。（见图1）
经24小时培养后，生长情况为：（图2）
经48小时培养后，细胞已长成致密单层：（图3）
加入2.5%胰酶后，细胞逐渐皱缩变圆，细胞间隙增大不再致密：
刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：（图4）
细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：（图5）
细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆：（图6）
细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：（图7）
细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观察贴壁半透明的细胞层，判断消化程度。（图8）

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:02

图2 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:03

图3 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:03

图4 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:03

图5 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:04

图6 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:04

图7 接上文的图片

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作者: summerxx 时间: 2012-4-16 13:04

图8 接上文的图片

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作者: yes4 时间: 2012-4-16 13:05

本人的感触"世上没有比细胞更难养的了，动不动就死给你看".我养细胞已经有一年了吧，刚开始跟同学学习还可以，但是后来我们自己完全独立操作了，事就出来了。过滤的培养基不能用，老是污染。没办法找原因，还是主任经验丰富，是滤纸惹的祸。之前的滤纸是很早以前的，很好用的。后来用完了，又换了一批。那时我很郁闷连这点小事都做不好那算什么呀。慢慢的好起来了，做了几次原代，还好没有污染。细胞长的也可以。可是后来又有一次原代培养，结果很蹊跷，细胞都死了，我们找不到原因。后来老师终于找到了，那就是我们的培养基的PH值出了问题，太碱了，所以细胞都死了。细胞培养确实想养自己的孩子一样，细心地对待它，就会好起来的。记得不能偷懒。有一次，周六周日我和我同门都不想去实验室了，周一过来一看细胞都飘了，好惨呀。还得从头再来。

作者: woshituzhu 时间: 2012-4-16 13:05

养细胞已经7年了，养过很多细胞，包括原代培养等，最多时一个人养了8株细胞，只见我从早到晚“霸占”着超净台，培养瓶等等，惹得实验室的兄弟姐妹们个个怨声载道。幸好技术员老师支持我，说实验室养细胞唯一放心的就是我。主要是我替她做了不少工作，保了许多实验室以前没有的细胞株的种，而且复苏后仍然长势良好，给后面的师弟师妹们省了许多心。其实养细胞就是要细心，多想为什么，细节决定成败！不同细胞生长条件千差万别，要多看文献，多摸索。有时看着下面的师弟师妹们，我都吓死了，弱弱地替他们担心。上面有站友说启蒙老师很重要，我同意，开始养成的坏习惯，很难再改正。我很感谢我启蒙老师！

作者: is2011 时间: 2012-4-16 13:06

培养细胞有5-6年了，也来谈谈我的体会：
1，对待细胞要象对待自己的孩子一样，要用心呵护，不能让它渴着，饿着，及时喂食给它，并创造良好的环境，让它茁壮成长
2，细胞是有感情的，你对它好，它也对你好，很给你争气的，你想它怎样，它就会顺着你的意思，否则，就象淘气的孩子一样，不听你的话
3，细胞也有心情低落的时候，所以尽量赶在它心情好的时候让它做事，这样才能事半功倍，我可以举个例子，我最初养U937细胞时，想让它分化，用尽了各种办法，加LPS+PMA，不同浓度和时间，可是细胞就是没反应，我就把这个实验搁置了一段时间，有养活它一段时间后，和它混熟了以后，重复以前的实验，结果只用PMA分化效果就非常好，以后的实验就自然很顺利，上图片：1＃[img][/img]
4，每种细胞都有自己的个性，要按他们各自的特点来培养，
如我养的平滑肌细胞很活跃，喜欢热闹，2－3天就好多人口，而且不太爱吃喝，真是最好养的孩子了2＃[img][/img]
内皮细胞和平滑肌细胞性格相近，不过它很不讲卫生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要经常换洗才行3＃[img][/img]
RAW264.7细胞也很开朗，而且很能吃，要经常喂它，头疼的是细胞很容易活化，培养它的瓶子和环境没有内毒素才好，不过我这个当妈的很难满足它了4＃[img][/img]
脂肪细胞3T3-L1正如它的名字，很慵懒，不活跃，他们倒是很团结，经常手拉手不分离，不需要我太多照顾5＃[img][/img]
成骨细胞MC3T3也是很安静的，爱和我玩隐身，想看清它的动向有点难，不过不需要我经常照顾它，自己就长的很好，算是比较省心的6＃[img][/img]
肝细胞L02让我很担心，好像生病了，不晓得染了病毒很是什么，长倒是长，就是觉得不健康7＃[img][/img]
还有很多癌细胞，就不祥述了，他们都是很听话的，只要对他们好点他们也不会调皮的
图片如下：

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作者: 3648755 时间: 2012-4-16 13:08

我是个新手，也就养了半年细胞，我的感觉是养细胞一定要足够细心。忘记提前准备好所有的东西，我曾经犯过的错误，结果是我的细胞半死不活，平时四天就能长满的细胞养了十几天还没满，搞得我情绪非常不好，导师也对我没好脸。当然无菌操作是必然的，体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

作者: tianmei001 时间: 2012-4-16 13:08

我6月份开始正式养细胞，所说不到一个月，那个心酸和痛苦已经体会到了。刚开始买细胞株回来，养的特别好，也没人带我，都是一个人看资料来养的。本来状态超好，传了三代，有七八瓶细胞，因为没冻存管没冻存，等我那瓶旧培养基用完了换了一瓶新配的培养基细胞两天全死了，欲哭无泪！所以一定要冻存。
另外一点就是一定要细心，记得我第二次传代的时候，加入胰酶7、8分钟怎末都没动静，后来一看我把谷胺酰胺当胰酶了，两个的瓶子一样的，凭感觉就拿过来了用了。幸好不是对细胞有毒的。还有一次换液，一不小心吸头落到培养瓶里了，就用镊子取出来，增加了污染的几率。

作者: zhenxin 时间: 2012-4-16 13:09

我和老公都养细胞有将近6年了,算是熟手了,但是有时还是会不时出点问题,细胞就象孩子一样需要悉心的照料,老公以前养肝细胞,现在养干细胞,我呢,以前养了不同种类的血管内皮细胞,现在样平滑肌细胞希望大家多多交流哈

作者: one 时间: 2012-4-16 13:09

我养了10年的细胞，从原代细胞到VERO细胞至现在培养MRC-5，2BS，HPF等二倍体细胞，真像以上各位所谈到的那样坚辛，真像侍候小孩子一样，也有过污染，但都是由于使用液体包装过大，一次用不完多次使用造成的，现在细胞培养状况很好，但是自己仍然想再进行培养基的优化，不同细胞株使用的培养基及血清是不同的

作者: ritou1985 时间: 2012-4-16 13:10

感谢这么多热心人提供的图片
不过大家可不可以对于细胞型号备注清楚一点啊？

作者: 911 时间: 2012-4-16 13:11

今天细胞心得：养细胞是一门艺术！

作者: woshituzhu 时间: 2012-4-16 13:11

请问有谁分离过脐血单个核细胞吗？我分离过一次，可是镜下观有很多的红细胞，还有其它一些杂质细胞，哪位高手分离过纯的单个核细胞，请指点一下，谢谢了。我的具体步骤如下：采脐血50ml,冰盒内储存，一个小时后分离（因路途的原因），先用羟已基淀粉沉降一个小时（4度），取上血浆于另一离心管中，再用淋巴细胞分离液分离血浆，方法步骤同用淋巴细胞分离液分离外周血，离心后去上清，用PBS洗涤两次，用含10%胎牛血清重悬培养，镜下观见很多的红细胞以及一些杂质细胞，请问用什么方法可以去除这些红细胞啊，我用淋巴细胞分离液分离外周血单个核时非常好，可是分离脐血效果就很糟糕了。急，请各位多多指教

另外，分离脐血后我用药物干预两天，请问这两天用什么培养好啊,只用含10%胎牛血清的1640可以吗？

作者: 49888 时间: 2012-4-16 13:11

本科毕业时就养细胞，但是当时整个实验室的细胞状态都不好，大家换衣是污染了一种黑色小胶虫的微生物，为了能顺利完成毕业答辩，只好改做ELISA。于是，从那时开始，细胞培养在自己的心里也就留下了阴影。研究生进实验室之后，分子生物学实验做完后，又开始跟细胞打起了交道，回顾一下细胞培养的历程，有如下收获：
1、细胞就像孩子，一定要像关爱孩子一样关爱细胞。一定要勤快，最好隔一天给细胞换一次培养基，且培养细胞时加的培养基一定要充裕，否则容易饿着它，它就会给你脸色看。冻存细胞的前一天要给细胞换液，这样有利于细胞保持良好的状态。
2、细胞污染的处置：污染了真菌后，如果肉眼见到霉团了，那就扔之吧；如果是只是在显微镜下见到少量的真菌，可以倒掉液体后，加入新的培养基，同时加入一定量的氟康唑，即可拯救细胞。当细胞培养板中发现霉菌污染时，而细胞又非常重要（如制备分泌单抗的细胞株时），这时可以关闭无菌操作台的风机，在有霉团的细胞孔中加入碘酊，作用5-10分钟后，吸出碘酊，这样可以避免其他没被霉菌污染的细胞孔中的细胞。
3、不同的细胞株，即使使用的是同一种培养基，也不要使用同一瓶培养基，还有，操作完一种细胞株后，不要没有经过紫外线照射就操作另外一种细胞株，以防细胞株间的交叉。

作者: wu11998866 时间: 2012-4-16 13:12

说一点，所用的血清，培养基及双抗等在用之前可以先分装，这样是避免污染的一个很好的方法

作者: bongte 时间: 2012-4-16 13:12

我也来说几句，养细胞时间不算太长，算来前前后后也有10来中细胞株，自己分离的原代细胞也有三四种了。癌细胞就不说了，长的都快也好养，有时候感觉随便养养就行，不过随便养养也不是随便说的，每次还是要按步就班的来，要不然里面长出其它活物来可就麻烦了。加点双抗是有必要的至少心里放心一些。增湿盘里可以放点硫酸铜对霉菌有些作用，定期清理很重要，再好的培养箱时间长了不清理也会出问题。孩子对了总有些偏爱，我最喜欢原代的心肌细胞了，在显微镜下动啊动的可有意思了。
个人几点经验：
1.自己的细胞自己养，让别人帮着换个液什么的总会不太放心，前期准备最好也有一个人来完成，自己准备的东西用着放心。
2.准备很关键，没有好的准备工作啥也别说，PH值、盐离子、灰尘、微生物都在等着你呢。
3.要多观察，多思考，有时候全信本本上的也是不行了，多思考，比如细胞诱导，文献上说诱导48小时，但是你的就不一定行，可能48小时全漂漂了，这个48其中换相同液一次文献上还没说呢呵呵。
4.绝对不能偷懒，该换液的时候换液该传代的时候传代。
5.分离细胞的时候千万注意文献上的RPM，呵呵不知道机器型号的RPM基本等于没说，知道型号不同转头也不行，水平离心跟45度角离心差别也大得很，不信你试试。
6。正常生长的细胞，拧紧瓶盖置室温一周细胞不会死数量也基本不会增加，所以你从别处快递来的细胞长途跋涉不是很脆弱的细胞都没问题，呵呵，偶然发现，不适用于所有细胞，当然大冬天的放室温肯定是不行了。

作者: wmp1234 时间: 2012-4-16 13:13

关于原代细胞培养的话，大家切记不满让它长的太满，在细胞大面积接触之前传代，大部分细胞在70%左右吧，宁可分早了少分几瓶也不要让他长过了。
原因：
1、原代细胞接触之后，会抑制生长（大多数细胞系也是如此啦）。这个抑制信号会导致你的细胞老化或分化。总之就使得你的细胞状态不行了。许多原代细胞养的注意的话养个20-30代的话细胞的原有特性还是能维持的。
2、原代细胞大多数时候很难保证100%纯的细胞，常见的杂质细胞是成纤维细胞。这个细胞要命的是他接触了还会继续生长。所以如果长的过满了，成纤维细胞会继续生长，导致在你细胞中的比例就迅速增加了。比如本来之后0.5%，长的过满之后下一代细胞中比例可能就是5%了。
以上经验是我一个在某原代细胞公司的朋友（可以说是世界上原代细胞种类最多的一个公司）传授的，希望对大家有帮助。

作者: shenkunjie 时间: 2012-4-16 13:13

新手，刚做了2批新生乳鼠心肌细胞培养，那个惨啊。第一次20个皿污染了16个，现在第2次很多黑疙瘩与细胞们紧密接触，难舍难分，不知道咋办好。。。。。

作者: remenb 时间: 2012-4-16 13:14

没养过孩子养过细胞，养细胞个人认为最需要的是耐心和细心，三天打鱼两天晒网是肯定不行的。
1、耐心。每天都要照看，了解它们。
2、细心。要细心的照顾它们。
细胞其实是和我们一样的有脾气的，如果养的好的话她和你是一起的，你好他就好，如果你心情不好他也就会随之不开心，曾经听人说过一句话，“要不然怎么说是我养的呢”。
细胞需要的是坚持，你要一直和他在一起，他才会好，你要是离他而去，他也就会和你自然分手再也不会理你了。你要为离开他付出双倍甚至更多的代价！所以千万不要离开你自己的细胞！

作者: qhyu 时间: 2012-4-16 13:14

DMEM细胞培养基的高糖和低糖对细胞培养影响并不大，我几年前刚开始做细胞培养时也常为此困扰。如果为了保险起见，选高糖的好了。培养基中的谷氨酰胺、丙酮酸钠浓度更重要，一定注意不同货号培养基之间的细小差别，最好选组分全加入的货号产品，毕竟省得不少另加试剂的开销。HEPES的添加也很关键，尤其对代谢旺盛的细胞更是如此。选血清时，宁可买Hyclone公司的新生牛血清，也不要用国产胎牛血清，切记。经济情况允许，建议用Hyclone的Define级血清，效果太好了。实际上国产胎牛血清都是新生牛，基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血，甚至不如进口新生牛血清，价格却相差不多。国产血清有的时候太“脏”了，其中的内毒素、支原体等指标都达不到要求，最近研究表明，内毒素是细胞凋亡的诱因之一。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活，灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。
Gibico的血清很好，我读硕士时一直用。但是最近两年由于疯牛病的原因（Gibico的血清不都产在美国和澳洲，也有疯牛病发生的国家），进口的少，价格也贵。同一价格的前提下，毕竟Hyclone的Define级质量更好。Sigma的血清也很好，质量标准比Hyclone的还严格。具体选那种，还得根据您的工作性质而定，毕竟在国内科研经费有限，除非老板有上千万的项目，可以不计实验成本。
关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。如果做MTT实验或类似的四唑盐参与线粒体代谢的实验，血清浓度尽可能低一些，一般5%-10%，可以减少血清对结果的干扰，尤其是采用水溶液法（如加10%SDS盐酸溶解而不用DMSO）时更加重要。如果您做流式细胞分析，需要分析细胞周期，要经过一个“同步化”过程，有的学者用血清饥饿法，也就是24小时不加血清，使细胞周期趋于同步化。
我的细胞传代原则：不用EDTA，只用胰酶，先用D-hank's洗掉残留培养基和血清，然后按1ml胰酶/10cm2培养面积加入，镜下观察，待到细胞回缩明显且尚未脱壁时（这个过程不超过1分钟），倒掉大部分胰酶，只保留细胞表面被少量胰酶湿润，37度培养箱中放置5-15分钟，直至细胞可象流沙状下滑，加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞散开，如有团块，可考虑200目筛过滤，可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害最小，如果做流式细胞分析，也可用此法，只不过在胰酶中加入等量EDTA溶液，出来的峰极规整漂亮。某些细胞只用常规培养基不行，还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长，要多参考相关文献。

另外，二氧化碳张力和温度也很重要，有些细胞需要较高的二氧化碳浓度或较特殊
的温度。可选用透气盖培养瓶或培养皿培养板培养。

作者: dongdongqiang 时间: 2012-4-16 13:14

有意义，今天刚得到人生第一株细胞，我这个比较简单，师兄把什么都准备了，只要换液，每天照看一下就行。师兄还是挺把我当回事的，什么注意事项都交代了，还有一些现在用不到但是养细胞必须的事项都说了。
只是第一天就不太如意，NF-KB本来就娇弱。昨天看的时候细胞还挺好的，那时就应该换个皿分两份了，今天一看，细胞长多了，成片飘了起来。吸掉上面的细胞后只剩一点点细胞，不知道移到新的皿里还能长好不。心里很忐忑啊。

作者: any333 时间: 2012-4-16 13:15

我的细胞传代原则：不用EDTA，只用胰酶，先用D-hank's洗掉残留培养基和血清，然后按1ml胰酶/10cm2培养面积加入，镜下观察，待到细胞回缩明显且尚未脱壁时（这个过程不超过1分钟），倒掉大部分胰酶，只保留细胞表面被少量胰酶湿润，37度培养箱中放置5-15分钟，直至细胞可象流沙状下滑，加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞散开，如有团块，可考虑200目筛过滤，可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害最小，如果做流式细胞分析，也可用此法，只不过在胰酶中加入等量EDTA溶液，出来的峰极规整漂亮。某些细胞只用常规培养基不行，还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长，要多参考相关文献。

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前天试用此法，非常好，以前我在室温消化30min都下不来的，在培养箱里5分钟就搞定了。
非常好。

作者: join 时间: 2012-4-16 13:15

刚开始跟师姐养细胞，来逛逛，才发现养细胞这么难了。
好好学习了一下，谢谢楼上所有的师傅们的宝贵经验和建议！

作者: 969 时间: 2012-4-16 13:16

不可否认以上的都是养细胞经验丰富的高手，
遇到高手我可要请教一个问题，不知道可否解答给小弟
我养的巨噬细胞，昨天传的代，出现紧缩成圆形聚集的现象，不知道是什么原因，有什么解决办法，我现在换液换成20%FCS,不知道怎么样，很焦急，希望得到帮助

作者: bohe221 时间: 2012-4-16 13:16

前脂肪细胞实验交流QQ群(95152108)。从事前脂肪细胞研究的同行朋友，多多交流学习。互相帮助，共同进步

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