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标题: [求助]如何研究转染细胞的NF－kB的激活？ [打印本页]

作者: nn255 时间: 2012-4-16 13:34 标题: [求助]如何研究转染细胞的NF－kB的激活？

我们知道NF－kB是即时转录因子，在干预因素干预的很短的时间内就能够启动表达。如果我们研究某一基因对NF－kB的激活，应该怎么做？将这一基因转染特定细胞，多长时间可以检测NF－kB的变化，转染基因的表达时间一般是24h，是不是可以在24h设定不同的时间点，比如24h 30h 36h时的NF－kB变化。我想用western blot的方法检测。

另外有人做过稳转细胞NF－kB的变化吗？如果瞬转后NF－kB升高，那么在稳转的细胞中NF－kB是不是会恢复原状？

作者: tangxin_80 时间: 2012-4-16 13:34

如果是检测对NFkb的激活，可以用nfkb的报告基因做荧光素酶检测。
或者做EMSA

作者: nn255 时间: 2012-4-16 13:35

有用western blot检测的吗？不想构建质粒了。

作者: hyuu 时间: 2012-4-16 13:35

有几种方法可以选择：
1.EMSA：一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。
2.western blot：这个抗体应该用磷酸化的P65抗体，，因为只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有钱的话，可以连总蛋白和磷酸化蛋白一起做，比较完善。
3.免疫组化：也是可以的，原理跟western blot差不多。
4.双荧光素酶：还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。
总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。

作者: 2541 时间: 2012-4-16 13:36

一般来说比对照细胞还是要高，
另外最好要做knockdown实验某种程度上比overexpression更有意义些

作者: abc816 时间: 2012-4-16 13:36

做emsa和luicifence

作者: chuntian1983 时间: 2012-4-16 13:37

做luicifence吧，测测报告基因还是很方便的，并且数据可靠，如果做western的话数据不准确，并且工作量比较大，我现在就在做的工作有一部分和你的一样，我也在测一个基因对NF－kB信号通路的影响，用的promega的双荧光素酶报告系统，试剂盒稍微贵了一点，但是做起来方便，至于NF-kB报告基因，不用自己构建的，自己构建的灵敏度不可能达到商品化的质粒，在国内买就可以了，碧云天就有卖的，也就600到700吧，要他们给你打个折。现在做信号通路权威的方法还是报告基因的方法，你还是放弃你的western的想法吧。

作者: bananapeople 时间: 2012-4-16 13:37

美国Signosis 公司研发的NF-kB滤板法检测试剂是一种高通量的检测方法，可同时分析多个标本，较非放射的凝胶迁移试验简单的多，较基于放射的凝胶迁移试验安全的多，与基于ELISA的检测方法相比花费更少，还可以定量比较。

作者: pengke1983 时间: 2012-4-16 13:37

可以用western测NF－kB的激活啊，但是测的时候检测的是NF－kB的入核量和IkB的活化。见过用western检测NF－kB的激活过程的英文文献。
EMSA和luicifence也都可以啊。
另外觉得，western是检测的NF-kB入核，EMSA是检测的NF－kB与DNA的结合能力，荧光素酶双报告基因检测的是NF-kB的反式激活能力。这3个实验是从三个不同的角度来检测NF-kB的激活的，一起做最能说明问题，但是不能说谁好谁不好。
另外反对hwclove的说法“2.western blot：这个抗体应该用磷酸化的P65抗体，，因为只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有钱的话，可以连总蛋白和磷酸化蛋白一起做，比较完善。”
这个说法我觉得是错误的，P65的磷酸化现在检测出至少有6个位点，不同的刺激都可能会产生不同的一个或者多个位点磷酸化，磷酸化只能说会加强活化，对于NF-kB来言，不能说只有磷酸化的才激活，即使磷酸化不能入核也是没用的。磷酸化只是起到辅助说明的激活的作用，P65不同于胞浆内的其他蛋白，能否入核对于P65才是最重要的。大部分文献报道的时候，都只用的是非磷酸化的P65检测入核的情况来说明问题的。
另外有看过些文章报道，NF-kB由于会导致IkB的转录，刺激过后一段时间激活的NF-kB会被新生成的IkB抑制掉。但是也见过在某些疾病的报道中NF-kB持续性激活。由于看文献有限，不知道你的稳转细胞会怎么样。

作者: pengke1983 时间: 2012-4-16 13:38

还有，免疫组化，个人觉得对于检测入核的情况不好，看核易位不清晰。大部分文献的报道，用的是激光共聚焦来看NF-kB的入核情况，看的时候细胞放很大来观察一个或者几个细胞，这个和western检测的目的是相同的。

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