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标题: [求助]细胞出现匪夷所思的污染，有高手能帮忙分析一下吗？ [打印本页]

作者: 33号 时间: 2012-4-20 11:41 标题: [求助]细胞出现匪夷所思的污染，有高手能帮忙分析一下吗？

之前一直养得很好的L6大鼠成肌细胞发生了怪事。刚复苏的时候还好，可是第二次传代24h后，培养皿中总有那么集中的一两块空白区域没有细胞贴壁（若是污染，为什么其它地方有贴壁较好？而且换了其他品牌的平皿、孔板，都是这样），该区域周围的细胞变圆，或者是变得形态怪异、看了都觉得恶心。细胞生长明显滞缓，培养液颜色正常、清亮，背景比较干净，看不出明显污染，偶尔有几个比细胞明显小的亮圆点。另外，变圆的细胞周围似乎有小颗粒包围，如果继续培养，细胞继续变圆，飘起，死亡，而且也是集中一片一片的死。会不会是支原体呢？郁闷中。

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作者: 33号 时间: 2012-4-20 11:41

再贴一张放大的

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作者: 33号 时间: 2012-4-20 11:42

这张中，黑色箭头是比较正常的梭形形态。红色箭头处细胞形态变化，伸出触角一般。黄色箭头处细胞变扁，很难看。桃红色箭头处显示死细胞周围似乎有东西。蓝色箭头处是一些小的亮圆点。

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作者: 66小飞侠 时间: 2012-4-20 11:42

如果找不出原因的话可能是你的血清不适合你的细胞，换个血清试试，有的细胞认血清

作者: rxcc33 时间: 2012-4-20 11:43

细胞培养小技巧2---诡异的“划痕”

问题描述：

有一次观察心肌细胞的时候突然发现瓶底出现些许“鸿沟”--形状规则，长短不一的“空白区域”，该区域寸细胞不生，而且区域两侧的细胞搏动频率也不相同。

当时心下大惊：怎么回事，昨天观察还没有这些问题的。

第二天再次观察，发现居然有部分细胞了，却不见跳动。

第三天，该区域细胞增多，不跳。

陷入沉思，却百思不得其解……

猜测原因：

始终有意识的记着这个事，终于发现，原来是在换液的时候，不小心吸管的尖端，触到了瓶底，硬生生的将细胞刮掉了。于是出现了空白区域，原来是被自己硬生生划出来的，这样两侧的细胞就失去了联系，搏动就不同步了。置于又出现的细胞可能是增生的成纤维细胞了

猜测是否正确，悬疑正在继续。

水落石出

于是在以后的操作中，坚决不接触瓶底，空白区域消失。至此，水落石出，划痕事件结束，一切都是操作不注意惹的祸。（虽然有时候还是不能避免，但是比以前少多了）

经验总结：细胞操作是一个精细活，虽然千虑，但总有一失。遇到这种情况，一定不要放过，至少有意识的记下来，想着去解决，这样才一点一滴的积累经验，一点一滴的进步！！

从别处帖子看来的不知道是否跟你的问题一致。我是新手，还没进实验室，很可能出错，请仔细鉴定。

作者: qumm1985 时间: 2012-4-20 11:43

我想应该不太像是ls所说的这种情况！呵呵

作者: HP007 时间: 2012-4-20 11:44

我想也不应该是楼上的楼上说的那种情况，分析来看的话，按楼主的意思，该特殊区域的细胞和正常区域的细胞形态上都有很大区别，可能有两种原因可以解释
一、该区域有少量细菌污染源，抑制了正常细胞的生长，所以造成空白区域，而且与周围细胞形态都不一样
二、该区域由于细胞传代时吹得不均匀，细胞分布也不均匀，造成局部地区细胞绝对数量偏少，细胞生长受到接触抑制，因而张的少

具体鉴别的方法，楼主需要搞清楚，该细胞在生长幼期和老化期有什么区别。
本人认为既然楼主大细胞大部分生长旺盛，应该不用太担心，传代一两次可避免。

作者: yhz1973 时间: 2012-4-20 11:44

我换液的时候，液体滴下去的部位把细胞都冲走了，那一片就不长的

不过我是做神经细胞，不知道LZ这个是不是

作者: Ao7 时间: 2012-4-20 11:45

我想也不应该是楼上的楼上说的那种情况，分析来看的话，按楼主的意思，该特殊区域的细胞和正常区域的细胞形态上都有很大区别，可能有两种原因可以解释
一、该区域有少量细菌污染源，抑制了正常细胞的生长，所以造成空白区域，而且与周围细胞形态都不一样
二、该区域由于细胞传代时吹得不均匀，细胞分布也不均匀，造成局部地区细胞绝对数量偏少，细胞生长受到接触抑制，因而张的少

具体鉴别的方法，楼主需要搞清楚，该细胞在生长幼期和老化期有什么区别。
本人认为既然楼主大细胞大部分生长旺盛，应该不用太担心，传代一两次可避免。

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首先,谢谢大家的帮助!!我养这个细胞的时间比较久了,首次遇到这个情况。一两个月前养的同一批冻存的细胞都很好。
我想不是传代的问题，因为别人用了我分给她的细胞，传代后，也出现同样的情况，而且似乎更严重，大片的区域只有变圆的较稀疏的细胞分布，细胞慢慢死亡，换了人操作，也换了培养基，结果一样，所以怀疑更像污染。
最近又复苏了一次，东西除了血清（新买的），都换了新的，培养箱也灭菌处理了，结果还是难逃恶运。所以现在很怀疑新用的这批血清，品牌种类和之前一样，还是某进口品牌（H牌）的特级胎牛血清。昨天问别人要了一瓶他们的同种血清，又复苏了一次，不知结果如何，等两天就知道了，额的神啊～

作者: duoduo 时间: 2012-4-20 11:45

你不妨换个培养基，换个进口血清，我们一直用百分之十PAA血清，HYCLONE的DMEM养的细胞特别好

作者: zzzz 时间: 2012-4-20 11:45

如果是种在皿里的话，是不是在皿中央的位置出现的几率高些呢？如果是这样的话，我觉得可能是因为你在换液或其他操作时，液体被吸除后，在超净台内开盖搁置的时间长了，细胞在超净台内的气流作用下变得干燥了。若是这样，以后做的时候，可以每次少换几个孔的液。

作者: zzzz 时间: 2012-4-20 11:46

另外，你箭头所示的那些结构，我觉得都是在细胞爬行，迁移和伸展过程中发出的胞质突起或者说伪足样的结构，尤其在早期，这些突起的边缘是会有些颗粒样的高密度的结构，应该是骨架相对集中的地方。细胞完全伸展开侯就很少见到了。一家之言，不知道对不对。

作者: 33号 时间: 2012-4-20 11:47

首先，感谢各位兄弟姐妹的帮助。
换了血清，情况还是一样，复苏2天后细胞生长良好，传代一次，情况良好，生长迅速，传代第二次，生长变缓，已发现大培养皿中还是有空白区域，突然觉得这会不会是被一种病毒污染，从而出现的空斑呢？大家觉得呢？

作者: ending 时间: 2012-4-20 11:48

我养的是肿瘤细胞，部分时候也有相似的情况，生长比以前减慢，但死亡的较少。
也出现相关的小亮点（比细胞小很多），我高度怀疑是支原体或衣原体污染。
我曾经用可乐必妥高浓度处理，有一定缓解。

作者: chuntian1983 时间: 2012-4-20 11:48

什么都换新的了，还是出现“空斑”似的东西，怎么办啊，实验都停了一个月了，都没法和老板交代了。上传昨天拍的的照片，大家看看，神啊~~~~~~~~~

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作者: chuntian1983 时间: 2012-4-20 11:49

放大看看，空白的地方蛮干净的

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作者: jrwyyplt 时间: 2012-4-20 11:49

如果不嫌麻烦的话，倒是可以做一下细胞的活力测定，看看细胞的状态如何。

作者: greenbee 时间: 2012-4-20 11:50

有没有换过其他品牌的培养瓶？楼主试试。

作者: lagua123 时间: 2012-4-20 11:50

谢谢大家，所有的东西我都换过了，只是培养基每次是新开一瓶同一批次的，我现在更换了另外一批培养基，情况似乎有所好转，但还不能确定问题已经解决，再观察几天。

作者: ALALA 时间: 2012-4-20 11:50

我想问一下楼主，你的培养液传代时有变颜色吗？细胞有没有明显的增值呢？我以前有次细胞感觉被污染了，但是觉得又不像，培养液养好几天都不怎么变颜色，呈桃红色，细胞也不怎么增值，也可以看到一些小亮点，后来我一个师兄看了后，说是已经污染了，而且应该是支原体污染。供你参考一下，楼主再仔细找下原因。
另外楼主说到是复苏后细胞才出现这种状况，所以有可能是你冻存前细胞有些轻微的污染，可能没发现吧~

作者: 2541 时间: 2012-4-20 11:51

该区域由于细胞接种得不均匀，造成局部地区细胞绝对数量偏少。我觉得不是污染。

作者: okhaha 时间: 2012-4-20 11:51

既然你换了培养基情况可能好转，说明可能是这个问题，就是你的培养基里面的谷氨酰胺流失的比较厉害了，你试着补加一点进去看看

作者: 8964357 时间: 2012-4-20 11:52

我想问一下楼主，你的培养液传代时有变颜色吗？细胞有没有明显的增值呢？我以前有次细胞感觉被污染了，但是觉得又不像，培养液养好几天都不怎么变颜色，呈桃红色，细胞也不怎么增值，也可以看到一些小亮点，后来我一个师兄看了后，说是已经污染了，而且应该是支原体污染。供你参考一下，楼主再仔细找下原因。
另外楼主说到是复苏后细胞才出现这种状况，所以有可能是你冻存前细胞有些轻微的污染，可能没发现吧~

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原来的培养基是从外面买的，也一直在用他们公司的，之前也没有出现什么问题。这一批次的培养基没开封之前颜色比较偏黄（感觉这里有点问题），但是加到培养皿里再在培养箱里放置一段时间后，颜色就是那种比较正常的红色，不是偏碱那种桃红，细胞复苏后第一次传代前后生长状态不错，但是以后增殖较以前明显变慢，而且养两天后，培养基颜色没有变化，还是红色。另外，我用的细胞是来自同一批冻存的细胞，之前用的几管都很好，所以应该和冻存无关。

作者: viviwang1987 时间: 2012-4-20 11:52

会不会是微量的支原体污染呢？楼主可以把该区域周围细胞取出来做一下hochest染色，看看周围小东西是否是支原体。

作者: zwsyrt 时间: 2012-4-20 11:53

酵母菌污染，建议用两性霉素或氟康唑冲击

作者: pengke1983 时间: 2012-4-20 11:53

LZ,请教你一下，你养的这个细胞还需要诱导分化吗？我是个新手，周围也没人跟我养一样的细胞，所以想跟你讨教一下，谢谢。

作者: wmp1234 时间: 2012-4-20 11:54

是不是在操作的时候被液体冲刷到了？以前自己做实验的时候有过这个时候，尤其是培养板。

作者: utt0989 时间: 2012-4-20 11:54

A：使用同批培养基及血清培养其他细胞，看是否出现相同现象。有，培养基的问题，继续查是哪个成份出问题。则说明培养基没问题。
B：同批细胞（同种细胞，重新复苏）用其他批次（品牌）的培养基及血清培养下，是否具有相同状况。有，细胞有问题。没有，你的细胞正常。
介于你已经用过其他批次的培养基了。可以试下A，看培养基是否有问题。

由于你的细胞会死亡，个人感觉是受污染的可能性比较大。
就看细胞在冻存之前有没有问题了。如果冻存前受到污染的话，那这批细胞基本就完了。
而你说的之前养的同批冻存细胞没问题的话，那比较大的可能是近期你们的细胞房或者培养箱受污染了。应该不是细菌霉菌酵母，可能是支原体或病毒吧。

作者: guagua 时间: 2012-4-20 11:55

支原体在倒置显微镜下能看到吗？为什么说小亮点会是支原体呢。我也遇到这种问题，细胞长得很慢，有好多小亮点，我怀疑是支原体，可是老板说支原体是看不到的。

作者: yhz1973 时间: 2012-4-20 11:55

楼主培养的L6大鼠成肌细胞出现培养空白抑制区，楼主不妨试试在相同的培养条件下，用同一种属的细胞进行培养试试，观察是否会出现类似的抑制区。此外，也可以试试不同的培养瓶，比如更换玻璃/塑料培养瓶。同意楼上euthor_hsu战友的说法，细胞死亡，污染的可能性大。

作者: 33号 时间: 2012-4-20 11:55

真心感谢各位的帮助，现在问题已经解决，把那一批次的培养基全扔了，换了某进口品牌配好的，现在细胞生长很好，转染效率也上去了，也没有看见那种空斑了。应该是那批培养基的成分有问题。

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