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标题: [求助]急，关于细胞培养的污染问题 [打印本页]

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 16:57 标题: [求助]急，关于细胞培养的污染问题

分离了2次肝星形细胞，都被污染了。
在接种培养不到12h，大约2h左右就可以看到有细杆状（短的是杆状，长的形状不规则，中间可以扭动，而且长短不一）物游动，而且方向朝一个方向运动，有的两端都可以摆动。虽然刚接种后观察没看到（有，但可能很少），第一次刚培养4h培养基就变黄了，长满了此物，增殖很快。
根据这些信息不知有人知道是什么来源的污染？谢谢。忘记拍图了。
灌流液及酶液都经过0.22um微孔滤膜过滤了。是菌类还是动物污染？

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 16:58

连夜拍出来了，太大了压缩后传上来，请高手指点，再次谢谢！200X

图片附件: 59603125.jpg (2012-4-20 16:58, 18.89 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11758

作者: misswu61 时间: 2012-4-20 16:59

应该是霉菌污染

作者: c86v 时间: 2012-4-20 16:59

先做个营养液培养，估计是营养液污染了，最好换新的营养液，用新的细胞，若细胞实在稀缺，你的细胞要是贴壁很好的话，可以用d-hank's或pbs用吸管使劲冲洗N遍，再用新的营养液。我去年污染的也是棒状的小东西，活动性很好，到处乱跑，繁殖极快，双抗不起作用，最后发现营养液污染了，用换膜滤器重新过滤营养液也不行，最后将贴壁好的大肠癌细胞冲了N遍，用新液才就过来，而贴壁不好的神经母瘤细胞则全换新的。这是我被污染的虫子：

图片附件: 72120320.snap.jpg (2012-4-20 16:59, 29.81 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11759

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 17:00

刚培养4h左右，观察污染和楼上的很像，应该就是吧。但是早上我一看，棒状的东西几乎全没了，变成了小黑点，会闪动。培养液变黄了。
我用的是新的培养液，而且别人用的也是这个牌子的，血清也可以排出污染。会不会是小肠来源的。
让我感觉奇怪的是：4h看到的是杆状，早上（约12h）看到很多点状的，100X看不到，200X可以看到，不断闪动（黑色点状，没有荧光）！
急呢，养了好几次，都是同一个污染，昨晚加了约1ml的100X双抗，可是都没有抑制效果，液都黄了，到底是什么污染呀？继续求助！有什么解决办法呢？能不能抑制其生长？谢谢啦。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:00

分离了2次肝星形细胞，都被污染了。
在接种培养不到12h，大约2h左右就可以看到有细杆状（短的是杆状，长的形状不规则，中间可以扭动，而且长短不一）物游动，而且方向朝一个方向运动，有的两端都可以摆动。虽然刚接种后观察没看到（有，但可能很少），第一次刚培养4h培养基就变黄了，长满了此物，增殖很快。
根据这些信息不知有人知道是什么来源的污染？谢谢。忘记拍图了。
灌流液及酶液都经过0.22um微孔滤膜过滤了。是菌类还是动物污染？

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原代？细胞株？

作者: skytree 时间: 2012-4-20 17:01

原代的啊。已经判断，霉菌污染的可能不大，那张图压缩了下，所以看不大清楚，不是菌丝。和霉菌污染的指标不一样。经人指点，说是黑胶虫?

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:02

我觉得是不是你的incubator有污染的可能？建议好好消毒你的incubator。

请问，你是做大鼠？还是小鼠？
肝脏消化的时候时间和collagenase的浓度怎么掌握的？
我也在原代，虽然能养出来，但是有个问题就是isolate完了后，HSCs的数量有点少，想提高细胞数。我现在一个小鼠能取80*10000个细胞左右。

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 17:02

兄弟，我也在摸索中啊。C57小鼠的，消化20-30min，磁力振荡，气浴38度。collagenase IV 50mg 50ml，效果还行。但有部分包膜部分组织没有消化下来

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 17:03

呵呵，我用的是collagenase type I， 180ml/L加入到消化液，37度水浴锅震荡消化30分钟。效果也还行。但是组织还是不能完全消化，剩下不少大块。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:03

可以考虑加pronaseE 破坏实质细胞，我是这样的，但是还是有没消化的团块，小心切碎吧，消化的就充分些。

作者: shenkunjie 时间: 2012-4-20 17:04

小黑点是什么弄清楚了么，我也遇到过两次，很多小黑点到处跑，细胞也不死啊

作者: owanaka 时间: 2012-4-20 17:04

不是做布朗运动的颗粒，应该是某种菌，尚不清楚

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:09

兄弟，我也在摸索中啊。C57小鼠的，消化20-30min，磁力振荡，气浴38度。collagenase IV 50mg 50ml，效果还行。但有部分包膜部分组织没有消化下来

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你这个条件下，一只小鼠能取多少HSCs细胞？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:09

不会很多，这几次都没计数，因为还不知道分到的是不是星形细胞，所以想培养后观察是不是，再计数

作者: eric930 时间: 2012-4-20 17:11

我用的是opti prep的15%，11.5%和GBSS 3层分离，兄弟是用什么方法？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:11

nycodenz正在摸索中。。。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:12

不会很多，这几次都没计数，因为还不知道分到的是不是星形细胞，所以想培养后观察是不是，再计数

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别人论文里1.13±0.27×10,000,000 stellate cells (mean±SD, n=21) were obtained 我好像怎么也达不到这么多阿，呵呵

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:13

nycodenz正在摸索中。。。

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呵呵，Gey’s balanced salt solution/8.2% Nycodenz/17% Nycodenz 你是参考这个比重梯度吗？没有用过Nycodenz

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:13

是的，你是杀大鼠吗？小鼠的话得率不可能那么高的。我是用GBSS和Nycodenz但是这个比较麻烦，GBSS什么的要除菌过滤，用其他缓冲体系可能直接高温灭菌就行了。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:14

是的，你是杀大鼠吗？小鼠的话得率不可能那么高的。我是用GBSS和Nycodenz但是这个比较麻烦，GBSS什么的要除菌过滤，用其他缓冲体系可能直接高温灭菌就行了。

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我不知道你的消化液含不含有葡萄糖，我是因为灌注液含有葡萄糖，所以没有办法高压灭菌，也是过滤的。

还有细胞得率，我参考的是
Expression of heat-shock protein 47 in mouse liver
Cell Tissue Res (1996) 284:341–346
这个论文给的数据，不是我编出来的。呵呵。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:14

我的也是有Glucose，看看。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:15

该文用的是ICR小鼠，我用的是C57小鼠，当然得率不会那么高了。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:15

该文用的是ICR小鼠，我用的是C57小鼠，当然得率不会那么高了。

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不好意思，请问一下，为什么ICR和BL6 取HSCs的话，得率会不一样？？

作者: pengke1983 时间: 2012-4-20 17:15

理论上，相同年龄的ICR小鼠的平均体重比C57的大，因此HSCs得率相对高。这就像大鼠和小鼠的关系那样。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:16

理论上，相同年龄的ICR小鼠的平均体重比C57的大，因此HSCs得率相对高。这就像大鼠和小鼠的关系那样。

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兄弟是想说，因为ICR的肝脏大，所以HSCs的得率高？？不好意思，我不是很了解细胞消化的理论，因为我刚开始养细胞才1个月。

我以前消化组织，并测定消化后组织中的氨基酸的时候，发现并不是组织越大，测出来的氨基酸越多。比如50mg组织中提出来的氨基酸和20mg中提出来的氨基酸在一个水平线，所以当时如果没有严格控制组织重量在50mg+/-1mg的范围内的话，做不出统计差异。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:16

你说的也没错的，所以用大鼠最好了。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:17

呵呵，兄弟做哪方面的课题阿？我是正在考察增殖调控（proliferation）

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:17

MTT

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:18

细胞还没分出来呢，唉

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:18

细胞还没分出来呢，唉

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细胞死亡率是个大问题，我觉得我的collagenase的浓度还有消化时间还得调整。肝细胞和其他的纤维细胞还有Kupper倒是分出来了，就是HSCs还是少，又不健康。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:19

看来你已经做的挺多了，星形你有图片吗？细胞大小是不是很小？刚分离出来是怎么鉴定的？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:19

另外，你一次杀多少只小鼠，细胞需要冻存到一定数目后再培养吗？

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:20

另外，你一次杀多少只小鼠，细胞需要冻存到一定数目后再培养吗？

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一次杀2只，因为pronase E 很贵

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:20

哦那能看到分到的星形细胞？是小鼠吗？C57？

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:20

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/12033417')

请参考这个帖子。还有我的小鼠是BL6

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:21

你的小鼠有经过什么处理吗？比如喂养维生素A等。另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？你是如何确保无菌的？谢谢！：）

还有，你的protocol中的第7步是什么意思，文献中我也看到了那一步，就是11.5%和GBSS之间的细胞，应该怎么处理呢（肉眼能看到分到的HSCs？）？是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？这样对细胞损伤会不会很大？多谢！

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:21

你的小鼠有经过什么处理吗？比如喂养维生素A等。另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？你是如何确保无菌的？谢谢！：）

还有，你的protocol中的第7步是什么意思，文献中我也看到了那一步，就是11.5%和GBSS之间的细胞，应该怎么处理呢（肉眼能看到分到的HSCs？）？是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？这样对细胞损伤会不会很大？多谢！

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你的小鼠有经过什么处理吗？no
另外你一次分2只小鼠所得的细胞量肉眼能看到吗？离心后能在管子下面看到淡淡的白色的HSCs的沉淀，肉眼。
你是如何确保无菌的？呵呵，这个问题我无法给你回答，毕竟这个是操作，器材等等问题。自己好好检查细胞室的所有使用的东西和步骤，看看哪一步有可能让细菌之类的有机会进入你的培养基当中。
是小心吸取出来后用GBSS稀释后，1400gX10min吗？是的
这样对细胞损伤会不会很大？我不能保证你那边如何，最起码在我的实验室里损伤不是很大，因为细胞还是很健康的。

我也很多地方不是非常清楚，如果有说明错误的地方，请指教。谢谢

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:22

多谢啦，这周我争取做次实验，到时有问题再请教你了。我前面杀过几十只老鼠，有时一次10只，但是几乎都失败了，都是因为这样那样的原因。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:24

还有问题啊，血细胞污染是怎么处理的？灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？450g离心后你看到的血细胞多不多？我前面几次可以看到一层的红色细胞。optiprep你是用什么稀释的，GBSS？
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，吸取显微镜观察有细胞，但不能确定，15%那层导是没颜色，也没有观察到细胞。按你的protocol应该是11.5%上面有一薄层是HSCs，介于11.5%和GBSS之间。还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？希望能得到你的解答，谢谢！我想把这些问题搞明白了再做实验，否则恐怕又要一错再错了。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:26

多谢啦，这周我争取做次实验，到时有问题再请教你了。我前面杀过几十只老鼠，有时一次10只，但是几乎都失败了，都是因为这样那样的原因。

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请问一次杀10只，你怎么消化阿？几个肝脏放到多少的消化液阿？

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:28

还有问题啊，血细胞污染是怎么处理的？灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？450g离心后你看到的血细胞多不多？我前面几次可以看到一层的红色细胞。optiprep你是用什么稀释的，GBSS？
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，吸取显微镜观察有细胞，但不能确定，15%那层导是没颜色，也没有观察到细胞。按你的protocol应该是11.5%上面有一薄层是HSCs，介于11.5%和GBSS之间。还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？希望能得到你的解答，谢谢！我想把这些问题搞明白了再做实验，否则恐怕又要一错再错了。

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血细胞污染是怎么处理的？红细胞的比重为1.090~1.092，所以会到15%层。
灌流到淡黄色后，取肝的时还是有血回流，肝又变得有点红了，怎么办？有点血没有关系，毕竟不可能做到100%干净。
450g离心后你看到的血细胞多不多？这个是哪个步骤，我3层离心后，取上层的话，几乎看不到血细胞
optiprep你是用什么稀释的，GBSS？有好几种稀释方式，如果你买optiprep的话，它的说明书会跟着来，稀释液不同的话，比重会不同。
11.5%那层梯度液是什么颜色的？我的是浅黄色的，？？我记得你是用Nycodenz的吧，我的optiprep的11.5%和GBSS之间会看得到淡淡的白色条带。
还有个细节是用50ml的大管进行梯度离心吗？是的。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:28

可以考虑加pronaseE 破坏实质细胞，我是这样的，但是还是有没消化的团块，小心切碎吧，消化的就充分些。

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请问，pronaseE的目的是破坏实质细胞的吗？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:28

没错，如果感觉贵的话，其实不用也行，只要你组织消化的充分不要让实质和非实质粘附在一起就完全可以根据密度将不同细胞类型分开的。我是用了三种酶，灌流时2种，消化时再加上DNase I。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:29

有的文献里面pronaseE浓度很高，这个酶贵，的确是要考虑下，另外这对HSCs应该也有损伤。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:30

想问下你得到细胞的纯度怎么样？用什么方法检测的？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:32

没错，如果感觉贵的话，其实不用也行，只要你组织消化的充分不要让实质和非实质粘附在一起就完全可以根据密度将不同细胞类型分开的。我是用了三种酶，灌流时2种，消化时再加上DNase I。

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你上面提到，pronaseE是用来破坏实质细胞，是不是就是肝细胞？而下面的帖子说 “实质和非实质粘附在一起**分开”也就是用来分离粘在一起的HSCs和肝细胞？不是很明白因为我觉得这2个理由似乎不是一个理由。我倒是倾向于下面的理由，因为消化的时候肝细胞必然会损伤，然后释放细胞浆内的东西，各种酶和蛋白，比如actin类，而这些蛋白就会使细胞们粘在一起，而pronaseE 本质上作为protease是可以分解蛋白的，所以能够去除那些使细胞们黏附在一起的蛋白的不好的作用。因为别人的论文里似乎没有提到，所以仅仅是猜测，不知道兄弟知道的情况如何？谢谢，请指教。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:32

想问下你得到细胞的纯度怎么样？用什么方法检测的？

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很严重的问题，我也正在解决这个问题，hsc倒是能得到不少，但是能看到不少其他细胞。下面的图是我养了4天的细胞，部分已经活化。

图片附件: 49191601.snap.jpg (2012-4-20 17:32, 19.95 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11760

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:33

前面几天换液应该要离心吧，HSCs应该要几天才能贴壁，如果Kuppfer贴壁时间早的话，就可以通过直接倒出培养基将其去除。看来纯度问题的确是很大的问题，光密度梯度可能解决不了。
你的操作是按AJP或者HEPTOLOGY上面的protocol做的吧，貌似这些文章分到的纯度都大于90%。不知道这些人是怎么分的。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:34

前面几天换液应该要离心吧，HSCs应该要几天才能贴壁，如果Kuppfer贴壁时间早的话，就可以通过直接倒出培养基将其去除。看来纯度问题的确是很大的问题，光密度梯度可能解决不了。
你的操作是按AJP或者HEPTOLOGY上面的protocol做的吧，貌似这些文章分到的纯度都大于90%。不知道这些人是怎么分的。

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HSC贴壁在24小时以内，很快的。我也觉得纯度不光靠一次的密度梯度能搞定的。我的protocol是混杂了2个论文上的，呵呵。今天我要修改我的protocol，看看能不能提高纯度。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:34

密度梯度可能就这样吧，而且每个批次的小鼠可能还不一样呢，估计得慢慢摸索了。如果采用流式细胞分选的话纯度就高了，不过这个比较贵，得率低。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:34

很多论文都提到了先低速（30G， 5min）可以去掉肝细胞，然后取悬浮液在梯度离心。
但是，我试过了，30G离心5min后，几乎所有的HSCs都沉下去了。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:35

又半个月了，实验还没任何进展。我也觉得或多或少会有点损失的，其他层面的细胞我也观察过了，可能也有一些星形细胞。昨晚用荧光显微镜观察了分到的细胞，不多。养的时候没看见菌，早上看了下已经有不少了，想500gX5min离心洗一下，没想到连个细胞的影都没有（昨天收集到的HSCs在1.5ml管底有小黄点大）？也不知道问题出在哪，最烦人的估计是染菌了，各个步骤都灭菌了，估计就是样品阶段出问题，取肝的时候手不干净。

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我个人觉得，肝脏在体灌注，然后放到管子里消化为止，还是很脏的。然后消化结束后，0.22micrometer过滤网，过滤得时候会把细菌类的去除掉。所以我觉得你污染应该是在过滤步骤以后的环节，没有达到无菌操作。请参考

不好意思，发现自己解释错了，消化结束后是用70micrometer的过滤网，这个大小只能把没有消化干净的大块的肝脏组织和其他大块垃圾去除掉，但是细胞，还有细菌类应该是去除不掉。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:35

是不是你们的恒温箱什么的不干净啊？前一阵子我们的就不知道被谁污染了，箱子内壁上有灰黄色不知道什么的东西在上面，然后好几个人的细胞都污染了。操作时候因为都在超净台做，应该没有问题。而且你的所有试剂都0.22过滤了，所以试剂也应该没有问题。

作者: duoduo 时间: 2012-4-20 17:37

我以前的污染和steven2008的图片一样，应该是霉菌污染，双抗没有用的，我用了十倍的双抗都一点效果都没有。有一次放置超过２４ｈ，观察到霉菌菌落了……
对细胞生长有影响的，测的流式调亡和ＭＴＴ结果很乱……
后来我弃掉了

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:37

没有其他人也养，别人都好好的。你说消化得到的细胞悬液细菌很多，那后续操作你是怎么消除这些菌呢？

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我没有说消化得到的细胞悬液细菌很多，呵呵，我说会有细菌，多少就不知道了。而且，我只有分离完细胞后，最后放入培养基的时候，培养基含有抗生素。中间过程并没有特别的除菌的操作。而且，我养了将近1个半月的细胞，目前还没有污染过，所以这个protocol下，是可以避免污染的。所以，是否再看看其他地方，是否有污染源。

而且我个人总觉得，污染后的细胞是不能够继续用于实验的。所以避免污染确实是很重要的。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:38

是啊，每次看到污染我都是痛心地扔掉了，一是怕污染别人正在培养的细胞，二是细胞也发生凋亡了，留着也没有用。这周5可能再试一次，老天佑我！对同一个实验室的人来说，要污染很不容易的，唉，我的原因在哪里呢？？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:39

我以前的污染和steven2008的图片一样，应该是霉菌污染，双抗没有用的，我用了十倍的双抗都一点效果都没有。有一次放置超过２４ｈ，观察到霉菌菌落了……
对细胞生长有影响的，测的流式调亡和ＭＴＴ结果很乱……
后来我弃掉了

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这位兄弟，的确加双抗没有效果，菌还是疯长。你确定是霉菌吗？我叫很多有细胞培养丰富经验的人看有的说是黑胶虫，确定是霉菌吗？如何避免呢？或者加什么试剂抑制？谢谢！

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:39

这位兄弟，的确加双抗没有效果，菌还是疯长。你确定是霉菌吗？我叫很多有细胞培养丰富经验的人看有的说是黑胶虫，确定是霉菌吗？如何避免呢？或者加什么试剂抑制？谢谢！

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是啊，我也有这个疑问，如果污染了，如何判断是什么病原体污染阿？仅仅是通过形态学观察吗？还是？还有判断这个是什么病原体有什么意义？请赐教。谢谢

作者: pengke1983 时间: 2012-4-20 17:40

真菌，好像有菌丝！

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:40

初步判断是霉菌丝状粘成一团然后就是会游动的杆状

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:40

我今天染了 alpha-SMA 结果太诡异了，呵呵，出来了大于95%的阳性染色结果。不知道是不是非特异染色结果，还是就是正确的结果。因为这次没有设其他细胞的阴性对照，所以不好解释。下次把肝细胞和其他fibro也一起养，然后做个对照染色看看。这个是第8天的图。

图片附件: 77077908.snap.jpg (2012-4-20 17:40, 22.25 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11761

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:41

挺漂亮的，是用荧光显微镜看的吧，不错啊。大概几天能贴壁？几天能活化？

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普通显微镜下看的
贴壁在24小时以内
3-4天开始部分活化，7天左右绝大多数活化。
这个是我养的HSCs的情况，请参考。

作者: tianmei001 时间: 2012-4-20 17:41

恭喜楼上的出来好结果。

请问活化的HSC还有实验的价值吗？

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:41

当然有啦，HSCs活化是肝损伤发生后肝脏的变化之一，所以可以研究活化HSCs的信号通路或者其他，阐明相关机制。另外也可用药物处理，观察变化，为研究药物机理，肝病药物治疗提供理论基础啊。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:42

恭喜楼上的出来好结果。

请问活化的HSC还有实验的价值吗？

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看你关注的是哪个角度了。你是希望研究 HSCs从静态改变到活化状态的过程？还是想看活化后下游事件。。。跟你的方案有关。。价值的话，，我觉得还是有的。
比如，活化的HSC 到胶原的沉积，这个过程的细节。
比如，活化后HSC增殖的调控
比如，对肝细胞凋亡的调控。

要做的工作还是有很多的。。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:42

细胞粘连问题还是很重要的. 抱着省钱的目的,这次取细胞的时候没有加pronaseE和少加了DNase。梯度离心的时候发现，下层的细胞沉淀明显增多，而上层漂浮的HSCs少了很多，所以，我觉得我的系统中的collagenase的浓度应该没有问题，或者稍微偏大，然后pronaseE和DNase是必不可少的。
一点经验，请参考。

作者: 66小飞侠 时间: 2012-4-20 17:43

我们这里的离心机有softbrake功能，平时默认的是非softbrake。

设置softbrake之后离心结束后离心机转子会慢慢的停下来，所以离心时间比非softbrake时要长。

设置参考说明书。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:43

跟Ca2+不知有没关系？最好用有钙的缓冲液溶解。

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细胞和层粘蛋白的结合是钙离子依赖性的，所以一开始第一个灌注液是calcium free 或者含有EDTA，这个是为了更好的消化做准备。但是，接下来加入collagenase后，collagenase的活性是会被EDTA 或者其他螯合剂抑制。而且，在有钙离子的条件下，collagenase会很好的工作。因此，第二个灌注液以及消化液是去除EDTA，加入钙离子的。如果解释有不对的地方，请指正。谢谢

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:43

实质细胞会粘附HSCs，因此没加Pronase的话肯定会有一部分会随实质细胞沉淀的。

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是的，一部分会随实质细胞沉淀的。但是如果胶原酶的杀伤力控制好，别然那么多细胞死亡的话，是否能够防止细胞内蛋白的释放，进而不需要pronase去切掉这些细胞外蛋白呢？我下次想尝试一下消化分3步（10min-10min-10min）来减少细胞死亡，看看是否有帮助。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:44

污染的问题：
这个问题我觉得跟实验室本身的条件，还有操作都有关系，因为我们实验室相对干净一点，动物都是SPF级别的，所以我上次试了消化液什么的没有用0.22micro过滤，配好了就直接用了，一开始培养基稍微脏，换过1次液后就没事了。所以，实验室本身的情节条件和操作当中的细节问题都很重要。

PronaseE和DNase的问题：我试了一次一个2个都不加，一个只加DNase。发现2个都不加的话，由于细胞中的genome和一些粘性蛋白的存在，细胞都成团，细胞大部分在消化结束，过滤大颗粒的时候卡在滤网。
只加DNase的话，虽然能够得到细胞，但是得率明显低于2个都加的情况。所以，我觉得这2个酶都是有存在的道理。

作者: remenb 时间: 2012-4-20 17:44

这个没有什么诀窍，就是多做自然就熟练了。另外根据不同梯度液，操作方法可能也不同。

作者: pengke1983 时间: 2012-4-20 17:44

以我的经验来看应该是真菌污染，
最好是弃之，
用抗生素基本上是徒劳。

作者: pengke1983 时间: 2012-4-20 17:45

请问楼主知道小鼠的HSC细胞的浮力密度吗？

是1.044吗？这个是按照8.2%nycodenz算出来的。但是按照11%nycodenz算出来的是1.058。

作者: toy 时间: 2012-4-20 17:45

请问楼主知道小鼠的HSC细胞的浮力密度吗？

是1.044吗？这个是按照8.2%nycodenz算出来的。但是按照11%nycodenz算出来的是1.058。

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液体的密度会根据不同的溶媒而改变，请问你这个计算的是用什么去稀释的？

作者: baidukk 时间: 2012-4-20 17:46

我自己整理了一个帖子：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=12300868&sty=1&tpg=2&age=0')

作者: baidukk 时间: 2012-4-20 17:46

液体的密度会根据不同的溶媒而改变，请问你这个计算的是用什么去稀释的？

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这个是按照nycodenz说明书的稀释液算出来的用0.75%氯化钠或者是7.45%蔗糖的配方。

作者: baidukk 时间: 2012-4-20 17:49

我明天整理个照片给大家看看，是不是HSC细胞。我第一次分的。

跟下面帖子里的instructorlyh照片
几乎一模一样。

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=10438122&sty=1')

作者: tieshazhang 时间: 2012-4-20 17:50

刚分离的星状细胞怎么鉴定呢？大小大概多大？我怎么看我的细胞都很小啊，像杂质了。

作者: utt0989 时间: 2012-4-20 17:51

前段时间，我的细胞老是出现污染，让我损失相当惨重，雪上加霜的是当时冻存的细胞冰箱有坏了，结果复苏后的细胞也全部死掉了，就剩1支冻存的细胞了，之后在培养液里加入左氧氟沙星 0.02ml/毫升培养液，效果不错，把以前污染的细胞终于挽救过来了，目前细胞状态良好，我目前一直用这个方法，都还不错，大家可以试试

作者: utt0989 时间: 2012-4-20 17:51

你的操作是按AJP或者HEPTOLOGY上面的protocol做的吧
楼主能不能把这两篇文章发到我邮箱。或者告诉我篇名也可。谢谢。

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