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标题: [分享帖]细胞爬片的保存和抗原修复问题总结 [打印本页]

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:41 标题: [分享帖]细胞爬片的保存和抗原修复问题总结

1. 细胞爬片可以用含叠氮钠PBS液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!!
加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04--0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题！

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:42

2. louischen wrote:但我的细胞爬片经过4％多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了－20度，还能用于免疫组化吗？！
应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:43

3. mRNA原位杂交经4％多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。－20度保存

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:43

4. 如果是4％多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。

5. 丙酮中固定5－10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5％的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会

6. 丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至4度冰箱备用。

7. （1）细胞爬片先用TBS洗3次，每次5分钟
（2）4%多聚甲醛固定，室温，20分钟
（3）70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:44

8.  我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后,就放在室温中,因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了,呵呵,所以放了一个月后去拍,还是很好

9.  细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。

10.  细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:44

11.  我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在4度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。

12.  细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了

13.  爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是：1）试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2）加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3）因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系：81825645。本人在湖南省肿瘤医院病理科（长沙市）做免疫组化。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:45

14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3个月是没有问题的。

15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，—-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。
如：1．多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
2．乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度
3．甲醛(福尔马林)应用最广优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:46

16. 4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原已被分解，再修复也没用！

17.  弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70℃长期保存。

18.  爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

19.  固定后放点PBS，然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:46

20. 固定后4度可以存放一周，－20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。

21. 四度放1周应该没问题的，你最好放在－２０度，我在－２０度放一个月都还出结果的．很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题．

22. 最佳的固定及保存方法：
(1)中性缓冲福尔马林（不必调pH）：
福尔马林（40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和） 10.0ml
Na2HPO4.12H2o 1.9653g
NaH2PO4.2H2O 0.5460g
加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至100ml。
（2）细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37℃PBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。
（3）将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固定30min。
（4）用镊子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20℃备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。
可以用于做免疫细胞化学（H.E.)或免疫荧光。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:47

23. 细胞爬片固定以后要放在-20度的冰箱.1个月内可以用.

24.  skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30％的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片？
爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片

25.  本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤压，防止粘片和碎裂。

26.  细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。

27. 1、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min，PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了
2、爬片PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否能保存，怎样保存？

1、洗过就可以做免疫组化了。
2、固定过后自然干燥，不要洗，-20度保存。做之前再洗。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:47

28.  细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。

29.  如果是检测膜上的物质,好象不能用酒精,

30. 适当密度后取出固定(丙酮-20固定10～20min)，再进行免疫染色。

31.  一批细胞爬片,如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20分钟，然后放-20度，没有问题。
如果细胞爬片是在24孔板或6孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。

32.  细胞爬片用纯丙酮固定10分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70度保存。

33.  4%多聚甲醛固定后PBS水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1月。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:48

34.  如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。

35.  可以买NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Thermanox™ Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。
上海生工有现货，不用国外定货。我使用后，觉得效果比玻璃盖玻片效果好很多。

36.  我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水（80%，90%，100%，100%酒精各一次，每次10分钟左右），然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。
这个方法我们试过的，保持一段时间后做，效果还是可以的。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:49

从上面的总结来看，大家多用多聚甲醛和或者丙酮固定，然后-20度保存至少1月，4度的话2周。
请问
1.如果用丙酮固定的话，因为他是有机溶剂，会和6孔板发生反应，请问大家是如何固定的，是把血盖片取出来粘到盖玻片上固定的吗？
2.关于多聚甲醛固定的爬片是否需要抗原修复的问题，先问一下，因为简单查下论坛，有人说需要固定，因为交联反应；有人说固定的时间短不需要修复。有时间的话我爬片是否需要修复再在论坛内搜索后做个整理总结

作者: fei1226com 时间: 2012-4-26 15:50

我的细胞爬片固定液用得是-20度与冷的丙酮甲醇（1：1混合）混合液，固定5-10min，当然，这一步是把爬片取出来放在玻璃培养皿中固定的（这一步一定要小心！！不能弄混正反面）。之后PBS漂洗三遍，自然晾干，放-20保存，我隔了一个多月取出来做免疫荧光也没问题。胞浆，胞核的着色都不受影响。
以前试过纯丙酮固定，细胞收缩非常厉害，害我的成纤维细胞变得跟小蝌蚪似的，根本没法用。

作者: c86v 时间: 2012-4-26 15:50

借形态宝帖求助高手！
我最近爬了不少片子，固定前镜下看细胞情况不错，细胞形态比较完整，铺展的也较开，结果当我每次用PBS洗2遍，75%酒精固定5-10分钟，然后再用PBS洗2遍后晾干并存放于4度冰箱，一周左右进行免疫细胞化学实验。
每张玻片出来的结果：镜下细胞的形态残破不堪，胞膜破碎不完整，甚至部分变形的比较厉害，直接导致组化结果不可信。一直不知何故，请几位形态版版主和各位高手帮忙分析一下，非常感谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11797

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:51

借形态宝帖求助高手！
我最近爬了不少片子，固定前镜下看细胞情况不错，细胞形态比较完整，铺展的也较开，结果当我每次用PBS洗2遍，75%酒精固定5-10分钟，然后再用PBS洗2遍后晾干并存放于4度冰箱，一周左右进行免疫细胞化学实验。
每张玻片出来的结果：镜下细胞的形态残破不堪，胞膜破碎不完整，甚至部分变形的比较厉害，直接导致组化结果不可信。一直不知何故，请几位形态版版主和各位高手帮忙分析一下，非常感谢！

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首先需要说明的是我现在还没有开始爬片，只是在查找资料，今天中午刚查到几个帖子，希望对你有用。
1.细胞爬片可以买专门的爬片，几块钱一小包的，爬片用前泡酸，高压消毒（包括镊子和枪头）。把用过的24孔板清洗干净，一孔一片，很方便，又互不干扰。把细胞培养到对数生长期，消化后再滴上去，爬1-2天贴壁后（中间可加适量培养液），可在板子里一直做完。清洗时，将PBS滴在片子上即可，不要剧烈摇晃。需要照相时候，再取出来，细胞面贴在载波片上，最好用50%甘油，中性树脂贴不好，容易毁坏细胞形态。取爬片时候，可以用枪头和镊子，或者用以下战友的方法。

2.是关于固定的问题，印象中是不用丙酮，否侧细胞形态变化很厉害，忘记了，刚才也没有再找着，实在丁香通找的，你自己再找找吧

供参考！等我做了爬片大家一起再讨论！

作者: 泡泡 时间: 2012-4-26 15:52

我前段时间做过细胞爬片，是用多聚甲醛固定的，当时也在考虑要不要进行抗原修复，最后没修复做了，结果显示时没问题的，可以做出来，所以就每次不修复直接做了，这两天又要开始做了，再试几次看看到底行不行在来这里跟大家交流经验。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:52

昨天晚上整理细胞爬片是否需要抗原修复的资料，最后的结果是
细胞爬片做组化不需要抗原修复，但是需要用tritonx－100通透。如果不放心的话，就像楼上泡泡520530战友那样先不用修复，出不来结果的时候再试一试修复！

整理总结】细胞爬片的抗原修复
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=14469722&sty=1')

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:53

为什么讨论抗原修复的问题？

福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:54

schwann细胞爬片后,我用过4%的多聚甲醛，很好。是爬片，不是石蜡切片对吧，那就不用抗原修复了。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:55

我做过的是血管平滑肌细胞的爬片，当时一位临床病理科的老师告诉我用70％乙醇固定，在4度固定12小时以上，做免疫组化比较好，我做着效果还好。关键是配多聚甲醛挺麻烦，还要60度水浴才溶解，呵呵，本人就图个简单了。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:55

不用抗原修复，用1％Triton－PBS孵育可有助于暴露抗原。

我现在做的BAX和BCL-2是用丙酮固定,不需要抗原修复,可以直接做组化了,效果还可以.

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:57

细胞爬片用于免疫组化要不要脱蜡水化？要不要抗原修复啊？？

因为细胞爬片本来就不用石蜡包埋，一般固定之后，可以冻于-20长期保存；实验时需要水化，一般20分钟左右；抗原修复不是必须的，因为细胞爬片要比组织切片抗原暴露好和保存的好，所以不需要修复。
但我看到过有的病理老师做Tunel时修复了一下，不过没什么影响。个人喜好的问题。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:57

细胞爬片的免疫组化是否需要抗原修复，如果需要应该用什么方法？另外免疫组化中应该注意什么问题？是否时间较长就容易出阳性结果？谢谢
用多聚甲醛4度固定，一般不需修复，根据需检测的抗原和抗原所处的部位而定，4度过夜的一抗孵育条件较易出阳性结果。
的确不需要。
不需要抗原修复，抗原修复主要针对的是石蜡切片因固定剂、石蜡的制作过程对抗原的交联或封闭作用。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:58

冷丙酮固定, 需要多一步tritonX100处理，以便于增加细胞的通透性。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 15:58

要用Triton X-100做细胞穿孔的。

抗原修复主要针对的是石蜡切片因固定剂、石蜡的制作过程对抗原的交联或封闭作用。单细胞所用的固定剂和石蜡不一样，过程不是很繁琐，固定时间也短，不用修复，但要充分灭活。

很多文献都介绍用冷丙酮或乙醇固定。我比较了两者的效果，觉得用80%的冷乙醇固定10分钟，固定效果比较满意。用纯丙酮或乙醇固定，细胞收缩比较明显。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:00

加不加Triton是和您要染细胞的抗原分布和用途有关：Triton的作用是在细胞膜上打孔，以便抗体进入！
a）如果要染抗原分布在细胞膜上面，那么就不能加Triton；
b）但是如果抗原分布在胞浆或核内，那加入Triton就显得比较重要（虽然细胞在固定后的通透性较活细胞大，但是还不至于让任何东西都过去！）；
c）另外作电镜时一定不加Triton。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:02

直接把培养板取出，吸出培养基，然后用预热的PBS洗三次（5min*3），就用4%的多聚甲醛固定做免疫组化，其余的步骤就没什么特殊了！

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:02

DAB显色完，不用酒精脱水，直接封片么？

细胞还可以，但是组织切片的最好还是酒精脱水。这样的观察结果会好一些！

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:03

聚甲醛固定后，tritonx－100通透，也可以不需要抗原修复的，正如xdb86所言在于你检测的抗原的要求，先不用修复，出不来再试一试！

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:04

整理过程中一些细胞爬片的小细节技巧

（1）爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
（2）PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏
（3）4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。我发现直接用4°C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。
（4）染色滴加抗体时，为了节省抗体，可以先把抗体滴加在干净的载波片上，然后玻片的细胞面朝向抗体倒扣，同时注意防止气泡和玻片的正反。一般24毫米的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练，抗体又足够，那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:06

爬片的前期处理
（1）取干净的盖玻片（剪去一角，以作为正反的标记）若干，用洗衣粉轻轻擦洗后烤干（注意轻柔，不要留下明显痕迹，方便以后观察细胞）。
（2）硫酸重铬酸钾过夜。
（3）取出盖玻片后，用自来水反复冲洗20遍。
（4）用一蒸水漂洗10分钟，三蒸水冲洗3遍。
（5）晾干后泡纯酒精过夜（主要是脱脂，也可用95%酒精），用镊子夹出（不能用手去接触玻片，否则应重新泡酒精脱脂），蒸馏水清洗后自然晾干（烤干容易使玻片留下水迹，而晾干的则清新干净）。
（6）高温高压消毒。
（7）再根据实验要求考虑是否包被多聚赖氨酸。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:06

个人的最后总结：

细胞爬片做组化不需要抗原修复，但是需要用tritonx－100通透，如果不放心的话，先不用修复，出不来结果的时候再试一试修复！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2012-4-26 16:07

借形态宝帖求助高手！
我最近爬了不少片子，固定前镜下看细胞情况不错，细胞形态比较完整，铺展的也较开，结果当我每次用PBS洗2遍，75%酒精固定5-10分钟，然后再用PBS洗2遍后晾干并存放于4度冰箱，一周左右进行免疫细胞化学实验。
每张玻片出来的结果：镜下细胞的形态残破不堪，胞膜破碎不完整，甚至部分变形的比较厉害，直接导致组化结果不可信。一直不知何故，请几位形态版版主和各位高手帮忙分析一下，非常感谢！

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酒精固定的细胞我只做过一次，还是直接固定完就接着做IHC，没出现什么问题。
我觉得你这种情况会不会是PBS漂洗时震动太大破坏了细胞的贴壁效果？我每次PBS洗的时候都是把爬片放在PBS里浸泡，不晃动培养皿，每到最后一次漂洗完的时候都在镜下看看细胞形态。还没有出现过你的那种问题。
还有一点就是细胞固定前第一次洗的时候我用的都是4度的PBS，曾经用过一次常温的细胞形态就不太好，不知道这个有没有关系？

作者: leifengta 时间: 2012-4-26 16:18

酒精固定的细胞我只做过一次，还是直接固定完就接着做IHC，没出现什么问题。
我觉得你这种情况会不会是PBS漂洗时震动太大破坏了细胞的贴壁效果？我每次PBS洗的时候都是把爬片放在PBS里浸泡，不晃动培养皿，每到最后一次漂洗完的时候都在镜下看看细胞形态。还没有出现过你的那种问题。
还有一点就是细胞固定前第一次洗的时候我用的都是4度的PBS，曾经用过一次常温的细胞形态就不太好，不知道这个有没有关系？

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楼上说得有道理，准备下次爬片留意下。
我用的PBS都是常温放置的，而且PBS漂洗时会来回晃几下，再加之我的细胞状态不太好，所以在免疫组化国程，可怜的细胞便越来越少，剩下几个也成变形金刚了！哎~不知和酒精固定有没有关系呢？据说酒精固定对细胞损伤大？那位高手问答下，谢谢啦！

作者: yueban-1147 时间: 2012-4-26 16:18

有哪位高手帮下忙。做细胞爬片染色时，所选用盖玻片有特殊要求吗？如无自发荧光盖玻片，因为我想做三维成像，有时片子背景比较深，很难做。有人用过吗？帮忙介绍一下！在哪儿可以买到无自发荧光盖玻片！有哪些公司有卖啊？多谢！

作者: zwsyrt 时间: 2012-4-26 16:19

细胞爬片：直接把培养板取出，吸出培养基，然后是用预热的PBS洗三次（5min*3）还是冷的PBS洗三次？用酒精、丙酮、多聚甲醛固定各有什么优缺点，哪种固定比较好？

作者: flower-201 时间: 2012-4-26 16:19

据我的感觉（免疫荧光），有机溶剂如乙醇、丙酮做出来会干净点，但会使细胞收缩，抗原向核周集中，形态不太好。多聚甲醛细胞形态保持不错但非特异性高点，可能跟前者是脱水剂后者是交联剂有关

作者: yysr238 时间: 2012-4-26 16:23

PBS还是用温的好，冰PBS很容易脱避

作者: idea2011 时间: 2012-4-26 16:23

求助：
我最近在作DC悬浮细胞的爬片，借贵宝地询问一下。
我的步骤是 ①将悬浮细胞离心，而后将细胞配成一定浓度5×10（5）
②将细胞液滴在多聚赖氨酸处理过的载玻片上，自然风干
③4％多聚甲醛固定20min ，晾干
④缓冲甘油封片
做完之后的镜下观察细胞的数目非常少，一个视野只有10来个细胞，完全达不到5×10 5次方浓度
请问有什么办法解决么？

作者: idea2011 时间: 2012-4-26 16:24

据说可以直接在24孔板里做，不必爬片，请哪位知道的大侠详细介绍下啊。

作者: 一叶 时间: 2012-4-26 16:25

反馈：我做了一次心肌细胞爬片组化，4%多聚甲醛(4度冰箱里取出直接用)固定15分钟，没有修复，没有用H2O2,效果很好！

ps：用一小块碎的载玻片垫在爬片下面，方便了许多。另外没有见到掉片现象，我嫌浪费抗体，所以用滤纸把片子周围都擦掉了，变成了一个稍微大一点的阻止了。呵呵不知道这样做的后果是什么，不过单就组化而言，效果还是蛮好的。

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