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标题: [求助]亚细胞定位GFP融合蛋白在核内呈点聚集状 [打印本页]

作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:50 标题: [求助]亚细胞定位GFP融合蛋白在核内呈点聚集状

GFP融合蛋白，803细胞爬片，lipo2000转染48小时，荧光显微镜拍照。

现在观察到的蛋白是定位在核内，但是有两个问题需要大家帮忙看看

1.蛋白荧光强度不错，说明表达高，但在核内多呈聚集点状分布，如下图绿光显示，我对形态学和亚细胞结构不甚了解，想请问各位：如果一蛋白在核内，是聚集还是弥散状都有，如果聚集得厉害，和什么细胞器或者染色质相关吗，请有这方面经验的战友各抒己见

2.DAPI染核后，发现GFP阴性（即未转染进去）的细胞，染核可见。
而 GFP阳性（即转染目的基因）进去的细胞，染核都几乎已不可辨认，需要调节不同的焦距才能隐约看到点核的样子

问题：这些GFP阳性的肯定是蛋白吧，那就是说，DAPI染的DNA已经快没有了，不管是降解还是别的原因，核的形态也没有了，那是不是说高表达（因为此时还能看到发荧光的蛋白，亮度很强）基因的细胞，都发生了凋亡或是死亡？形态学，形态学，形态学，呼唤高手。

大家走过路过，各抒己见，谢谢，谢谢。

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:51

这些都是GFP的，大部分呈聚集状，而不是均匀散在分布在核内，所以我想知道有哪些功能方面的信息与之相关

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:51

接上面

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:52

DAPI 染核发现只要是GFP阳性的细胞，核的形态都染不出来了，DNA到哪去了呢。
箭头所指处就是对应的GFP阳性细胞的核染，是对应的本帖第一张图。谢谢各位了

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作者: one 时间: 2012-4-29 11:52

这个还是跟具体蛋白有关的，
如果细胞核的形态还在，GFP表达和核定位都正常的话，细胞至少没坏死掉，没可能染不出DAPI的，如果你确定每个GFP阳性的细胞DAPI都染不上，我觉得有可能你的蛋白本身对细胞分裂周期或者染色体活动有影响。

作者: one 时间: 2012-4-29 11:54

另外你的DAPI也染的太难看了点，量加少了么？

作者: xingyi08 时间: 2012-4-29 11:54

有没有光镜的照片？最好是光镜结合荧光观察，确定细胞转染后的生长状态怎么样？如果细胞状态不好，很可能绿色荧光是非特异的，另外，看的DAPI染的也不好，看不出细胞核的形态，很可能你的细胞已经不行了！

作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:55

另外你的DAPI也染的太难看了点，量加少了么？

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其实DAPI已经染得很亮了，但我把亮度调低，增加曝光时间，这样才能看到GFP阳性细胞中染得若隐若现的DAPI的核，否则只是看到其他没转进质粒的细胞狂亮的核了

谢谢楼上的两位朋友的解答，也谢谢版主的置顶。

我又做了一次，这次是转染前细胞无血清饥饿24小时，转染分别从3h，8h，13h，20h不同时间点检测荧光表达。

这次不是做的爬片，观察的荧光显微镜放大倍数不够，就看不了亚细胞结构，但我发现了一个现象：
3h的时候没有表达
8h开始有表达（至于是不是确切8h还有待实验，因为我就测了这几个时间点）
13h，20h 都有表达，但我每个时间点取了五个不同的视野照相，计数表达绿光的个数，发现13h，20h表达的荧光数比8h要少了，难道蛋白表达一小会就降解了？？

还有，在8h开始表达的时候，绿色荧光绝大部分是离得很近的成对出现，白光下面看就是紧挨着的两个细胞，绝大部分都是这样，我想是不是正在分裂，或者是分裂末期的细胞才有这个蛋白的表达呢？下面都拍了图，请大家走过再看看吧，谢谢了

作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:55

3h的就不贴了，没什么荧光点点～～
8h的开始有荧光，而且是成对出现的居多，这种成对的GFP绿光在白光下看就是居于两个紧挨着的细胞中的，我想是不是转进去一个细胞，它分裂成两个子代细胞，最后分裂完成时这个蛋白行使什么功能，表达就高了？还是转染的质粒就是随细胞分裂表达了而已，是普遍存在的，与周期、分裂无关？请高人给个解答，谢谢

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:56

这张还是8h的图片，可以看出也是成对的居多

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:56

12h的，照了五个视野，表达量居然又下去了，没有8h的多了，还是成对的居多

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:56

20h，表达绿光的更少了

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:57

下面两张是放大了的，绿光和白光照片，先是只有绿光，呵呵，我总觉得这成对的出现有点什么意思，可是又不太懂

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:57

这是上一张开了一点点白光看看细胞形态的照片，可见还是两个或者紧挨，或者离得很近的细胞，我就是不能判断这是不是经过有丝分裂后的两个子代细胞（或则正在有丝分裂的），但要不是的话，难道转染细胞那么神奇，别的都没转进去，只是挨得近的两个细胞都转进去了？

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作者: vvmmoy 时间: 2012-4-29 11:58

感觉不像凋亡
如果要确定可以连续看看
最后细胞是否出现凋亡小体

作者: 987789 时间: 2012-4-29 11:58

感觉不像凋亡
如果要确定可以连续看看
最后细胞是否出现凋亡小体

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谢谢，那是否需要先同步化细胞，在分别以不同时间点做爬片观察呢，取哪几个时间点比较好呢

作者: loli 时间: 2012-4-29 11:59

也不用这样，可以先做一下预备看看，但是要连续的看。
其实染不出核的另一个可能就是胞内的DNA内切酶已经被激活，出现了很多小片段的DNA，也就是凋亡的开始。

作者: zhenxin 时间: 2012-4-29 11:59

成对细胞出现说明转染后细胞分裂了，其实不论转染什么都会出现这种分裂相细胞

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作者: zhenxin 时间: 2012-4-29 11:59

图中成对的也有，HepG2，转染GFP

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作者: 987789 时间: 2012-4-29 12:00

谢谢，可是我这个大部分是成对出现，而不像您贴图中所见的大部分还是单个细胞内的表达，所以才引起了我的注意

作者: zhenxin 时间: 2012-4-29 12:01 标题: 回复 #20 987789 的帖子

转染前要饥饿12h，这时候细胞一般都处于G0期，转然后有的细胞会分裂，所以成对出现转染阳性的细胞很正常

作者: 987789 时间: 2012-4-29 12:02

转染前要饥饿12h，这时候细胞一般都处于G0期，转然后有的细胞会分裂，所以成对出现转染阳性的细胞很正常

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谢谢您的解答，那如果我做一次不饥饿，也就是不同步化细胞进行转染，还是发现成对出现居多的话，能给我们什么提示呢，我对细胞周期方面知道得不多，麻烦大家了

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