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标题: [求助]关于淋巴细胞测活 [打印本页]

作者: okhaha 时间: 2012-5-2 15:21 标题: [求助]关于淋巴细胞测活

各位群友，本人是新手，关于淋巴细胞测活，具体步骤如下：
1：脱颈处死小鼠，无菌取脾
2：200目铜网碾碎过滤细胞，裂解液裂解一次，10%培养液培养cona刺激（5微克每毫升）48h
3:分离淋巴细胞，设药物组（刺激淋巴细胞增殖），细胞组，及空白组，加96孔板，细胞每孔90微升，调至10*6/ml,pbs至每孔100微升，继续孵育24h
4:每孔加cck8 10微升，反应4h后OD450测结果
OD值如下：空白组：0.178，0.183，0.179
细胞组：0.186，0.185，0.189
药物组：0.203，0.198，0.196，0.192，0.192，0.187（倍比稀释）
为什么OD值这么低？做了好几次，有时候空白组高于细胞组，是怎么回事？药物组有时候也不稳定，基本上没什么变化
另求MTT具体方法

作者: qhyu 时间: 2012-5-2 15:21

无菌取脾时可能有细菌感染（原代细胞最容易感染了），导致孵育时细胞死亡，此外，如果操作不熟练的话可能导致制备成脾单细胞后细胞死亡过多。以上原因都能导致OD值偏低。
建议修改内容：
1.200目过网后最好用PBS或其他洗液洗涤2-3次后再使用裂解液，然后用台盼蓝染色观察细胞活度（活度应大于95%），如果死细胞太多就没有了。
2.分离淋巴细胞前应观察细胞形态，是否有死细胞等。
3.分离淋巴细胞细胞后应该用台盼蓝染色，观察细胞活度（活度应大于95%），并调整细胞浓度
3.培养液里一定要加抗生素
4.96孔板尽量使用中间的孔，四周的孔可能有边缘效应（这个和板的质量有关），有时不稳定。
以上仅供参考。

作者: okhaha 时间: 2012-5-2 15:22

非常感谢，感染应该不会吧，培养液加了双抗，细胞活力可能不够，不过应该怎么样去保证细胞的活力，已经重复了好多次，都是这样

作者: qhyu 时间: 2012-5-2 15:22

做原代细胞时，即使加了双抗，感染的几率也很大，毕竟双抗不是万能的，很多细菌都能有抗药性。
从无菌取脾到制备成单细胞不能超过半小时，到放入培养箱不应超过4小时（最好不要超过3小时）。
无菌取脾使用的溶液最好是冰冷的，可以降低细胞耗能。
裂解时间要控制好，太短裂解得不好，太长影响细胞活性。我以前是用双蒸水0.5Ml裂解红细胞20s，加0.5ml双倍PBS，在加单倍PBS。
最后，可能有必要考察cona刺激剂的使用量。

作者: qhyu 时间: 2012-5-2 15:23

cona浓度很重要，太高、太低都不行。而且每个批次的都得做预试

作者: woshituzhu 时间: 2012-5-2 15:23

悬浮细胞MTT在多次细胞洗的时候，会随培养液跑掉的，千万小心，可以试验后用离心机（可以离板子的）离一下，轻轻吸取外液，细胞里的颜色很重要。那是数据呀。小心去外液是关键。

作者: caihong 时间: 2012-5-2 15:24

你一个96孔板的孔中种多少细胞？我是指CONA刺激之后的。我觉得你的读值恐怕是结果的真实反应，你的96孔板中恐怕没多少活的细胞，另外，我不是非常明白为什么要用CONA来刺激淋巴细胞，CONA是一个非特异性的刺激剂，对所有的淋巴细胞都有刺激作用，我以前做实验的时候用CONA刺激小鼠的淋巴细胞72小时后，淋巴细胞没多少活的存在。我觉得试验流程应该是这样的
1 取小鼠淋巴细胞，计数
2 将小鼠淋巴细胞种入96孔板中（具体数目应该由你的预试验来确定）
3 加入待测药物，培养基（阴性对照），CONA（阳性对照），以及无细胞单培养基的本地组（或者加入待测药物，如待测药物对结果影响大），37度培养48小时
4 加入CCK8进行测定

作者: yes4 时间: 2012-5-2 15:24

你一个96孔板的孔中种多少细胞？我是指CONA刺激之后的。我觉得你的读值恐怕是结果的真实反应，你的96孔板中恐怕没多少活的细胞，另外，我不是非常明白为什么要用CONA来刺激淋巴细胞，CONA是一个非特异性的刺激剂，对所有的淋巴细胞都有刺激作用，我以前做实验的时候用CONA刺激小鼠的淋巴细胞72小时后，淋巴细胞没多少活的存在。我觉得试验流程应该是这样的
1 取小鼠淋巴细胞，计数
2 将小鼠淋巴细胞种入96孔板中（具体数目应该由你的预试验来确定）
3 加入待测药物，培养基（阴性对照），CONA（阳性对照），以及无细胞单培养基的本地组（或者加入待测药物，如待测药物对结果影响大），37度培养48小时
4 加入CCK8进行测定

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我想请教一下楼上的，给药组：是ConA和药物一起加，还是只加药物的？
我也在做脾淋巴细胞MTT
我的实验设计是这样的，请指教
1 取小鼠脾淋巴细胞，计数
2 种96孔板
3 加药：(1)加细胞，不加ConA，不加药;（2）加细胞，不加ConA，加不同浓度药物；(3)加细胞，加ConA，不加药；（4）加细胞，加ConA，加不同浓度药物
4 培养24小时后MTT检测

作者: HP007 时间: 2012-5-2 15:25 标题: 回复 #8 yes4 的帖子

我不知道你为什么要加入CONA，一般来说CONA是作为阳性对照存在，当然有可能CONA对于你的试验有帮助并已被文献报道，那这种情况下你就要考虑的是你的对照的问题了。从你上面的试验设计来看，对照设计的不错，但还得加上其他的阴性对照。另外，你确定你的药物能作用24小时后引起淋巴细胞增殖并效果显著？一般来说，药物不可能有这么强的刺激效果，CONA、PHA等非特异性刺激剂除外，如果有这么强的刺激效果那这药就是毒药了。

作者: yes4 时间: 2012-5-2 15:26 标题: 回复 #9 HP007 的帖子

谢谢指导~~~~~
但是我还是有些不明白的地方：
1，我是要做免疫增强剂的，已有文献表明，ConA是非特异性刺激剂，在脾淋巴细胞中加入我的药物和ConA，如果脾淋巴细胞增殖>只加入ConA刺激的结果。我想是不是可以证明我的药物有免疫增强的作用呢。
2，我还想问一下，如果选择ConA作为阳性对照，ConA+药物作为实验，只有药物作为阴性对照，这样对不对呢？
再次由衷的感谢你的不吝赐教！

作者: ladyhuahua 时间: 2012-5-2 15:26

请教楼上的高手们：怎样判断培养的淋巴细胞是死的还是活的？能单单从形态上判断吗？谢谢！

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