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标题: [求助]细胞中的黑颗粒 [打印本页]

作者: c86v 时间: 2012-5-2 16:53 标题: [求助]细胞中的黑颗粒

我的细胞最近老师出现黑色的颗粒，大的可以成团，接种后两三小时观察就可以看到好多黑色的，细胞都看不太清了，颗粒不动。师姐跟老师都说是细胞碎片，但是细胞碎片会出现这么快，这么多吗？会不会是污染？换液冲洗后可以减少很多，换液后细胞可以长，但是状态不好。求助高手指导

作者: ha111 时间: 2012-5-2 16:54 标题: 回复 #1 c86v 的帖子

有照片吗？我也遇到过，但是不是道你说得黑颗粒是在细胞之间还是细胞上得……我也想知道到底是怎么了

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-2 16:54

出现以上黑色不动的颗粒有两种情况：
1.支原体污染。细胞周围都是，换液颗粒减少，但见快速生长，细胞张至40%以上，成片脱落。2.细胞衰老导致凋亡，产生碎片，换液后会减少。
根据你的描述，可能是支原体污染，建议换新的细胞重新培养。

作者: kewanqi2011 时间: 2012-5-2 16:55

同意楼上，但最好是上图片看看。最好是高倍镜拍的。

作者: mimili_901 时间: 2012-5-2 16:55

三楼的说换液颗粒减少，但见快速生长，是什么快速增长呢，我用HBSS冲洗几遍后换液黑点不见增多呀，但是原代培养第二天神经元长的没有正常的形态，是那种肿大的，感觉像被什么掏空了，只剩个躯壳了那种，换液后慢慢开始好一点，有神经元正常的形态。

作者: mimili_901 时间: 2012-5-2 16:56

我用的是0.1%的胰酶消化13-15 分钟，10%FBS的DMEM/F12终止消化，HBSS冲洗，各种液体都已经反复配置了N 遍，还是一样。神经元明显感觉是缺乏营养那种状态，郁闷

作者: mimili_901 时间: 2012-5-2 16:56

支原体污染不是不容易观察吗？我的细胞接种时看上去还可以，隔2-3小时看就开始有很多黑色的团块了，细胞之间，严重的时候细胞都被遮盖的看不见了，要用HBSS冲洗好几遍细胞才能看到，第二天换液的时候看到的细胞就很脆弱，感觉风一吹就不见了似的。好的时候换液后2-3天逐渐有神经元的形态，胞体透亮，很多时候还是不怎么好。
支原体存在与什么地方呢？我的培养基都做了培养基试验没有问题，所用的液体有都换了很多次，而且都用微孔滤器滤过的。金属器械和玻璃器皿整个实验室的处理方法都一致呀，为什么我的养不好呢？
支原体有什么好的办法解决吗？

作者: zwsyrt 时间: 2012-5-2 16:57

0.1%的胰酶消化13-15 分钟,时间好像太长了吧？建议你在吸去培养基后，消化前用高压的pbs洗一遍，这样可以吸取细胞间的残留培养基，还可以洗去所谓的黑点，而且很容易就消化下来，你所说的黑点我们在细胞培养中也经常遇到，可能是培养基里面的血清结晶或其他，至于你细胞传代后长的状态不好，考虑是消化时间太长了，影响细胞活力，我们平时几分就可以消化下来我们实验室也有人在养神经元细胞，养的很好

作者: mimili_901 时间: 2012-5-2 16:57

我一直是做的原代呀，不是传代，而且我们实验室养神经元一直是消化这麽长时间的呀，我们实验室去年11月细胞间整修了一个月，之后我的细胞就一直这样了

作者: misswu61 时间: 2012-5-2 16:58

细胞碎片还是污染？

[ 本帖最后由 misswu61 于 2012-5-2 16:59 编辑 ]

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作者: misswu61 时间: 2012-5-2 16:59

还有一张，细胞上有黑颗粒，细胞间也有，不颤动！

图片附件: 60929116.snap.jpg (2012-5-2 16:59, 35.3 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11928

作者: qumm1985 时间: 2012-5-2 17:00

你的两张图焦距不同，轻轻来回动一下细调螺旋，黑点就没了。呵呵。丹心一，你看到的很可能是黑焦虫，如果是支原体，细胞培养液会变成发紫的红色，PH值变高。黑焦虫培养液不会有变化。你单独培养一下培养液，观察有没有你说的现象，如果有哪证明是培养液污染了，如果是支原体应该是血清里的，0.22的膜是无法除去支原体的。不过我还是倾向于认为它是黑焦虫，因为这个季节比较容易生长，春秋季。

作者: misswu61 时间: 2012-5-2 17:00

以前用的国产显微镜感觉细胞形态还是很好的，换了进口的照的太清晰了，还有换了血清的品牌，有一些细胞裂解掉了搞得背景比较脏，细胞上有一些小疙瘩不知道是什么，消化以后再贴壁还是那样，细胞得肿瘤了？呵呵

作者: star#room 时间: 2012-5-2 17:01

污染是肯定的我也遇到过。看着都吓人。你pbs洗完后，传代，大概大概6小时左右的时候，细胞贴吧状态还可以，但是在过2－4小时，细胞表面超多的灰尘状类似碎片的东西，覆盖细胞，要稍微摇晃一下才能看到细胞,
此时，若用pbs洗一下，发现细胞状态还可以，灰尘状的东西也少了但很快又很多了。

具体是什么污染物尚待高手验证

作者: star#room 时间: 2012-5-2 17:01

我上面照片里的颗粒是不增多的，放一晚上放一天还是那么多，消化冲洗也去不掉

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-2 17:01

你的培养液加双抗没有，如果没有，就用PBS洗下细胞，再加上含有双抗的培养液，也许能解决问题。

作者: 2541 时间: 2012-5-2 17:03

培养液浑浊吗？你的照片不很清楚，有没有使用莱卡的显微镜照的？

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谢谢楼上的，给你投一票！以前用的国产显微镜感觉细胞形态还是很好的，换了进口的照的太清晰了，还有换了血清的品牌，有一些细胞裂解掉了搞得背景比较脏，细胞上有一些小疙瘩不知道是什么，消化以后再贴壁还是那样，细胞得肿瘤了？呵呵

--------你说得碎片是因为换了显微镜才看到得还是说患了血清才造成的……你说的情况我也在去年得下半年开始遇到，不知道你使用得是什么牌子的血清，新生牛？小牛？还是胎牛？国产的还是进口得？

作者: jrwyyplt 时间: 2012-5-2 17:03

如果不能解决问题，你就改下培养细胞的方法，让细胞状态好点。

作者: zhenxin 时间: 2012-5-2 17:04

还有一种可能是血清本身的原因，有可能是血清灭活时间太长，导致血清内的蛋白聚集。其实如果是胎牛血清，不需要灭活，同时还能保持血清中的营养成分，使细胞生长的更好，楼主可以试一下。

作者: 2541 时间: 2012-5-2 17:04

如果不能解决问题，你就改下培养细胞的方法，让细胞状态好点。

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怎么改变方法，具体是什么呢？

作者: 2541 时间: 2012-5-2 17:04

还有一种可能是血清本身的原因，有可能是血清灭活时间太长，导致血清内的蛋白聚集。其实如果是胎牛血清，不需要灭活，同时还能保持血清中的营养成分，使细胞生长的更好，楼主可以试一下。

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如果是国内得血清，不灭活可以吗？有的老师建议是国内得血清不灭活不使用，但是也有说灭活之后，很多营养会析出，如果不做免疫得话，不灭活也可以，到底是不是呢？

灭活我一般是56度，30分钟，可以有一次居然有一个团块析出，不知道是什么？

作者: kulee 时间: 2012-5-2 17:05

团块可能是脂蛋白析出，没问题的去除就好，这应该证明这个血清不错，国产血清有些还是不错的，但有些可能营养成分少些，我做过试验同样条件，国内某些血清细胞状态可保持2天，国外进口的却可以保持5、6天，还是有差别的。最好是灭活以下，可以去除一部分支原体。

作者: kulee 时间: 2012-5-2 17:05

如果支原体污染，不确定生长液有没有被污染，不想倒掉，怎么处理一下，确保生长液是好的？

作者: c86v 时间: 2012-5-2 17:06

你看到的很可能是黑焦虫，如果是支原体，细胞培养液会变成发紫的红色，PH值变高。黑焦虫培养液不会有变化。你单独培养一下培养液，观察有没有你说的现象，如果有哪证明是培养液污染了，如果是支原体应该是血清里的，0.22的膜是无法除去支原体的。不过我还是倾向于认为它是黑焦虫，因为这个季节比较容易生长，春秋季。
我的培养基做了培养基实验没有问题呀

作者: ero11 时间: 2012-5-2 17:06

我觉得你细胞里黑色的是黑焦虫，同意楼上的，我以前实验也遇到过。衣原体污染情况不和你说的一样，黑焦虫污染最大的可能是血清污染，你的血清没有问题吧？

作者: 00无名指00 时间: 2012-5-2 17:07

我以前养细胞的时候也遇到过培养基里有大量的黑色颗粒，换液后会少一些，但一两天后又迅速生长。我认为不是细胞碎片，同意楼上的是黑焦虫，很难去除。很影响实验结果。建议，排除培养基和血清没问题后，重新复苏较低代次的冻存细胞。

作者: xue258 时间: 2012-5-2 17:07

我也遇到过这个问题，具体是什么至今还没有搞明白，这种东西在你细胞不是很多的时候可能不是很多，但是当你的细胞快长满，准备传代的时候他就会长得很快。这种污染不会让你的细胞死掉但是会影响细胞的生长速度，我们曾经试过换液时用pbs多洗几遍，然后加上四环素和乳酸环丙沙星，好像对这种黑色物质有抑制作用当时并不能出去，所以你还是把这一批细胞全部丢掉，拿一支第2代的细胞养，如果可能可以考虑换一下血清也换新的！

作者: xue258 时间: 2012-5-2 17:08

我也遇到过这个问题，具体是什么至今还没有搞明白，这种东西在你细胞不是很多的时候可能不是很多，但是当你的细胞快长满，准备传代的时候他就会长得很快。这种污染不会让你的细胞死掉但是会影响细胞的生长速度，我们曾经试过换液时用pbs多洗几遍，然后加上四环素和乳酸环丙沙星，好像对这种黑色物质有抑制作用当时并不能除去，所以你还是把这一批细胞全部丢掉，拿一支第2代的细胞养，如果可能可以考虑换一下血清也换新的！培养箱最好也用酒精擦拭一遍！

作者: c86v 时间: 2012-5-2 17:09

楼上的可否告知四环素和乳酸环丙沙星的具体浓度呢，我正在尝试加抗生素

作者: yes4 时间: 2012-5-2 17:12

你的问题和我原来遇到的问题太类似了。就是细胞刚传代的时候比较少，随着细胞增多，像沙尘状的东西也增多，到现在我还是没明白到底试试什么污染

作者: c86v 时间: 2012-5-2 17:13

三楼的说换液颗粒减少，但见快速生长，是什么快速增长呢，我用HBSS冲洗几遍后换液黑点不见增多呀，但是原代培养第二天神经元长的没有正常的形态，是那种肿大的，感觉像被什么掏空了，只剩个躯壳了那种，换液后慢慢开始好一点，有神经元正常的形态。

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比如你换液后，细胞周围洗得很干净了，但第二天又见小黑点出现。或者你用胰酶消化，吹打下来，离心后转移至新瓶。本来细胞贴壁后是干净的，但第二天细胞周围出现一点小黑点，两天以后都布满了。

作者: c86v 时间: 2012-5-2 17:14

我也遇到过这个问题，具体是什么至今还没有搞明白，这种东西在你细胞不是很多的时候可能不是很多，但是当你的细胞快长满，准备传代的时候他就会长得很快。这种污染不会让你的细胞死掉但是会影响细胞的生长速度，我们曾经试过换液时用pbs多洗几遍，然后加上四环素和乳酸环丙沙星，好像对这种黑色物质有抑制作用当时并不能除去，所以你还是把这一批细胞全部丢掉，拿一支第2代的细胞养，如果可能可以考虑换一下血清也换新的！培养箱最好也用酒精擦拭一遍！

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我认为你遇到的问题是黑胶虫污染，如果是支原体，细胞会成片死亡。如果是细胞衰老，细胞从培养开始就长得慢，即使颗粒少，也容易漂浮，容易聚集成团生长。四环素和乳酸环丙沙星对黑胶虫没有作用。最好还是采用如你后续的做法。

作者: yapuyapu 时间: 2012-5-2 17:15

最好在高倍镜下观察，黑焦虫和细胞碎片的运动幅度是不同的，细胞碎片的话是规则的小幅度的布朗运动，黑焦虫或其它生物污染物运动幅度不规则；另一方面可以从培养液颜色的改变以及颜色改变的时间判断，如果短时间（一晚上）明显变黄或者変紫都是污染的表现，细胞碎片是不会短时间出现颜色改变的

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