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标题: [求助]求高手指点我的原代培养 [打印本页]

作者: 33号 时间: 2012-5-3 15:16 标题: [求助]求高手指点我的原代培养

大家好！
我培养的是致密结缔组织中的细胞，反复经历挫折已经3个月了，精疲力尽，但是原代细胞还是没有培养出来，请各位高手指点一下小妹吧！谢谢啦！
具体细节：致密结缔组织为脊柱的黄韧带，外文文献上说的是组织块贴壁培养方法，具体细节为组织自手术室中取出后，我放入Dhanks液中，迅速转入无菌安全台操作，冲洗上面附着的骨、血和脂肪组织后，剪成很碎的小块，修剪的时候用的是低糖DMEM培养基浸泡，修剪完后用I型胶原酶加低糖DMEM消化，胶原酶的量为组织块量的20倍左右，消化时是在37度的co2孵箱内，消化完毕加入含有血清的培养基，1000转5min离心，去上清，剩余的组织块继续用PBS冲洗，再次离心，最后剩余的组织块放入细胞培养瓶中，加入极少量的纯血清（PAA胎牛）粘附组织块，是为了让组织块贴壁稳定，5个小时后翻瓶，此时再加入含有20%血清的培养基少量浸泡组织块，这样做是为了避免组织块飘起，3天换一次液体...但是这样的方法做到现在，只发现有少量的细胞自组织块的周围爬出，而且不贴壁...怎么办呢？我的细胞培养瓶内页用多聚赖氨酸包被了...呜呜呜，郁闷啊；我也试过用消化发培养节省贴壁时间，但是不成功啊，有高手指点一下吧！1.看我的操作过程对不对；2.组织块贴壁法对于致密结缔组织何时能有细胞爬出，进而贴壁？3.如果采用消化法培养，具体怎么做，有何种特殊之处呢？谢谢指点！

作者: 铜雀 时间: 2012-5-3 15:17

贴壁法
我们一般这么做
用剪刀剪成小块后
离心后用少量完全培养基吹打混匀
把1ml枪头前端用剪刀剪掉
用此枪头吸取混匀的组织块如培养瓶（量大约为0.6ml）
在培养瓶底部摇匀，均匀覆盖底部后将培养瓶翻转
加入3毫升培养基
4小时后翻转
就不用另外换液了

有几个点我不太明白
1、你使用I型胶原酶是去除某些细胞还是让致密组织内的细胞脱离下来，看起来你好像是去除某种细胞。
2、5小时翻瓶是不是时间太长？
3、如果使用一次性塑料培养瓶，最好不用多聚赖氨酸包被。做原代尽量不使用玻璃培养瓶。

以上是我的理解，不一定准确，没做过致密结缔组内的细胞。

作者: 铜雀 时间: 2012-5-3 15:17

建议方法的改良
1、不用胶原酶消化，也许会出现杂细胞。且细胞原代培养周期长。
2、减少一次离心。第一次离心的时培养基多用一些。
3、消化后过滤网，然后加入培养基培养。剩余组织块贴壁。如果你使用胶原酶是为了取得某种细胞。
4、纯血清粘壁，翻瓶时间缩短，3小时？
5、不使用纯血清贴壁，改用完全培养基。按照我上一个帖子的方法。
6、剩下的没什么建议了。看谁做过，帮你做一把。

作者: 33号 时间: 2012-5-3 16:40

非常的感谢您！
我使用I型胶原酶是因为我的致密结缔组织是由I型胶原组成，用I型胶原酶消化来获得我的细胞，使其容易自组织内部爬出；您建议在消化后使用滤网过滤，这样的目的是为了把残留的组织块剩余下来放入组织瓶内使用的，对吗？我会改进翻瓶时间，下次缩短试一下；一直用的进口塑料瓶培养；好的，我现在就是一直自己摸索做，很痛苦...也请教了几个高手看他们做，但是都和我细胞类型不同，致密结缔组织很少有人养，非常感谢您的指点，对我很有帮助！

作者: sunnyB 时间: 2012-5-3 16:40

1、你说的还是不清楚：胶原酶的浓度？消化时间多长？消化后还剩多少组织？收集上清里的细胞多少？这些细节不说清楚，没法帮你分析问题。
2、组织块法看似简单，实际上却是很难掌握的方法（尤其是新手）。最好有老手带你做，找找周围的老手帮忙吧。
3、根据你提供的信息分析，我感觉你还是用消化法更合适：用相对高一点浓度的胶原酶，多消化一段时间，最好一直消化到组织基本消失为止。

作者: 33号 时间: 2012-5-3 16:41

谢谢回复！
我用的是250U/ml，相当于0.2%的I型胶原酶，消化2个小时，在37度的co2孵箱内，消化后剩余很多大块的组织，这是不是代表没有消化成功呢？因为这个操作是在英文文献上查到的，他用消化2H后的组织去做原代培养，7-10天后有细胞爬出。您所说的收集上清里的细胞，那就是用了消化法是吧....我也尝试过消化法，最多用了4个小时，是不是消化的时间太短？我一直不敢用太长的时期去消化，怕造成细胞的损伤，但是昨天查了一篇最新的文献，说消化致密结缔组织可以达到10-20小时都没有问题。用胶原酶和DMEN的混合液去消化，是不是就不会对消化出来的细胞造成太大的损伤呢？再次感谢您的指点....盼回信...

作者: TAT 时间: 2012-5-3 16:47

非常的感谢您！
我使用I型胶原酶是因为我的致密结缔组织是由I型胶原组成，用I型胶原酶消化来获得我的细胞，使其容易自组织内部爬出；您建议在消化后使用滤网过滤，这样的目的是为了把残留的组织块剩余下来放入组织瓶内使用的，对吗？我会改进翻瓶时间，下次缩短试一下；一直用的进口塑料瓶培养；好的，我现在就是一直自己摸索做，很痛苦...也请教了几个高手看他们做，但是都和我细胞类型不同，致密结缔组织很少有人养，非常感谢您的指点，对我很有帮助！再次感谢

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呵呵，如果你使用胶原酶来消化你的细胞，那你过滤网，然后离心，或者2-3次消化，收集每次消化的细胞，加入培养基进行培养。
每次消化下来的时候，你可以离心后加入一定的培养基，取一滴滴到载波片上，镜下观察细胞数量或者进行细胞计数。这样就可避免细胞量太少而导致不成功。
进口的塑料瓶就不要用多聚赖氨酸包被了。
4个小时后翻瓶。因为按照你原来的方法，消化下来的单细胞附着在纯血清中5个小时，是否会影响其活性。

贴壁培养比较简单，你用的是消化+贴壁。如果你的结缔组织量足够多，可以多试验几种方法。1、单纯贴壁（不消化）；2、纯消化（2-3或者更多次的消化），过滤网收集细胞；3、消化+贴壁。

另外，我觉得，实验初期的不成功很常见，我们实验室的牛同志，原代做了半年，刚开始屡次不活，到后来细胞多的不可胜数，坚持下去吧。他有一次做了原代，让我们看细胞，我们劝他扔掉，因为细胞密度不到5%，然后他不扔，过了三周，全部长出来了，以后我们再也不敢说细胞少就活不了了。呵呵。

作者: sunnyB 时间: 2012-5-3 16:48

谢谢回复！
我用的是250U/ml，相当于0.2%的I型胶原酶，消化2个小时，在37度的co2孵箱内，消化后剩余很多大块的组织，这是不是代表没有消化成功呢？因为这个操作是在英文文献上查到的，他用消化2H后的组织去做原代培养，7-10天后有细胞爬出。您所说的收集上清里的细胞，那就是用了消化法是吧....我也尝试过消化法，最多用了4个小时，是不是消化的时间太短？我一直不敢用太长的时期去消化，怕造成细胞的损伤，但是昨天查了一篇最新的文献，说消化致密结缔组织可以达到10-20小时都没有问题。用胶原酶和DMEN的混合液去消化，是不是就不会对消化出来的细胞造成太大的损伤呢？再次感谢您的指点....盼回信...

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提些建议吧：
1、加大胶原酶浓度，我一般用625U/ml；
2、直接用DMEM配制，胶原酶本身对细胞的损伤就比较小，这样就可以进一步减少对细胞的损伤；
3、延长消化时间，我用625U/ml的浓度消化皮肤组织都需要2小时，你消化致密组织显然时间太短；
4、具体可以这样做：下午4点左右取材，组织剪碎，加入胶原酶，4度冰箱放置过夜（保证消化液浸透组织），第二天把组织连同消化液一起转入37度继续消化，每隔30分钟观察消化效果，同时把组织振动一下（手摇即可）以保证消化效果，一直消化到只剩小部分组织为止；过滤（可以省略），收集上清，离心（一次即可，不必过分追求离心效果，少量残余胶原酶不会影响细胞活力），收集细胞，接种培养；第二天观察，如果贴壁细胞很多，可以换液，细胞不多的话，3天换液。

作者: 33号 时间: 2012-5-3 16:49

我会继续坚持做下去，包括楼上您指点的下次加大胶原酶配制的浓度，或者直接用DMEM配置，我也想过，但还没有这样实施。因为现在刚过年，还没有手术的标本让我取，只能等待了....
我在过年之前做了3次原代培养，用的是“消化+组织块法”，就是把组织消化2小时后放在培养瓶中，现在已经10天了，昨天看的时候发现组织块周围有细胞爬出，大喜！但是换液后，可能是我的液量加的太多，那块附带有细胞爬出的组织块从液体中漂了起来！大悲！.....飘起来的组织块，细胞是不是就不能成活了呢，还有可能贴壁吗？欲哭无泪...
因为我就是害怕总换液，导致组织块漂起，所以一般3天换一次，把细胞瓶中的液体1/2换掉，如果有漂起的组织块就用吸管取出，剩余的组织块继续培养；我用的是20%的PAA胎牛血清，里面加了青霉素100u/ml和链霉素100mg/ml的双抗。现在我该怎么办呢？继续保持下去，有人告诉我1周不换液也没有问题，给细胞一个安静稳定的环境爬出或者贴壁，但我总担心如果有细胞会饿死，是不是我杞人忧天了？瓶中的液体变成什么样的颜色代表养分基本耗尽了呢？实验室都没有人就剩下我了...

作者: 33号 时间: 2012-5-3 16:49

对不起啊，刚才忘记讲，我不想动孵箱内的细胞，还想给它加点液体....想出了一个很笨的方法，别笑话我，不知道是否可行，也请教一下吧：）
我在超净安全台内用吸管把含有血清的培养基准备好，直接在孵箱内把培养瓶的口拧开直接往里加液体...这样既不动培养瓶，又加了液，行不？是不是污染的风险太高了...

作者: sunnyB 时间: 2012-5-3 16:51

说说我的组织块法：
1、组织块不一定很小，稍微大些没关系；
2、一定要锐利刀剪，对细胞伤害小；
3、最好用6孔板，把10块左右的组织均匀放置在一个孔内，液体不要加太多，以不超过组织块高度为宜，这样组织块就不会飘起来，第二、三天换液，方法同前，基本上组织块就能粘牢，以后可以逐渐增加液体量。我用这个方法做的基本上100%成功；
4、组织块掉了，可以马上转到另一个培养板继续按照组织块法培养；短期内一周换液没问题；液体变成黄色表示酸性物质增多，一般是大量细胞分泌代谢的结果，不变色并不代表营养充足，因为蛋白质在37度的半衰期是3天，即使没有细胞的液体37度一周后营养也差不多没了。

作者: sunnyB 时间: 2012-5-3 16:52

对不起啊，刚才忘记讲，我不想动孵箱内的细胞，还想给它加点液体....想出了一个很笨的方法，别笑话我，不知道是否可行，也请教一下吧：）
我在超净安全台内用吸管把含有血清的培养基准备好，直接在孵箱内把培养瓶的口拧开直接往里加液体...这样既不动培养瓶，又加了液，行不？是不是污染的风险太高了...

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风险太高。运气好的话，没事；运气不好，污染。

作者: toy 时间: 2012-5-3 16:52

风险太高。运气好的话，没事；运气不好，污染。

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呵呵
加进去以后还不是你想要的营养丰富的完全培养基

一般来讲
细胞量很少的话
可以1周换液
我们一般有的时候懒了
等液体有些发黄的时候才换液

作者: 33号 时间: 2012-5-3 16:53

那我就暂时先不换液，液体的颜色清亮还没有变黄，差两天到一周，我再耐心的等等...不过，昨天晚上，我观察了一下，好像有少量的细胞贴壁了，但还没有完全延展开，我需要的是成纤维细胞，有十几个....这就算是原代培养成功了吗？老天啊，就让我成功一次吧.....

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