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标题: [求助]封闭液的封闭原理及其选择 [打印本页]

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 15:50 标题: [求助]封闭液的封闭原理及其选择

最近做细胞免疫荧光标记，发现非特异标记很多，对照组（不加一抗）和正常组（加一抗二抗）基本没什么区别。疑似封闭液出了问题。是否要用羊血清封闭？但是很多人都有用到BSA；还是BSA浓度太小了？上网查，众说纷纭。我的方法如下
1、4%冷多聚甲醛4度固定20min，PBS洗三遍，每次5min
2、0.2%Triton透化处理20min，室温，PBS洗三遍，每次5min
3、0.5%的BSA（牛血清白蛋白）20min封闭，室温。不洗，倾倒掉多于液体。（以上在24孔板中操作）
取一载玻片，把爬片正置在载玻片上进行一下操作。可避免因孔板孔太大太大而浪费抗体。
4、一抗（兔抗鼠。1：100）孵育过夜4度，然后取出，正置于孔板中，PBS洗三遍，每次5min，取出，把爬片正置在一干燥载玻片上进行以下操作。
5、二抗（羊抗兔。1：160）室温1小时，注意避光（可放置在饭盒中），在二抗孵育40min是加Hoechst33258染色液染核20min，），然后取出正置于培养皿中，PBS洗三遍，每次5min
6、蒸馏水洗掉PBS，60%缓冲甘油封片
7、倒扣于载玻片上或是大的盖玻片上，镜下观察。

作者: zzzz 时间: 2012-5-7 15:51

QUOTE:

原帖由 redbutterfly 于 2012-5-7 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近做细胞免疫荧光标记，发现非特异标记很多，对照组（不加一抗）和正常组（加一抗二抗）基本没什么区别。疑似封闭液出了问题。是否要用羊血清封闭？但是很多人都有用到BSA；还是BSA浓度太小了？上网查，众说纷纭。我的方法如下
1、4% ...

标记方法的问题

作者: TNT 时间: 2012-5-7 15:54 标题: 回复 #1 redbutterfly 的帖子

试试延长封闭时间，调低二抗浓度。

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-5-7 15:54

好象大多是用血清封闭(通常用小牛血清)，为什么要用牛血清白蛋白？

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 15:55

谢谢楼上各位的意见，如果知道一些封闭的原理请告知或告知一些链接。
另外2楼说的“标记方法的问题”是什么意思？能否明确指明。谢谢

作者: zzzz 时间: 2012-5-7 15:55

对照组和正常组没有区别，那就可能是标记得方法有问题，还有我看到的的是90％的甘油封片

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 15:56

楼上说的标记方法问题是不是指一抗二抗选择的问题？谢谢！

作者: zzzz 时间: 2012-5-7 16:01 标题: 回复 #7 redbutterfly 的帖子

二抗是没有问题的，你用的是什么细胞，是鼠的吗？不是的话，就有问题啦。不是的话，一抗怎么结合上去？

作者: hot_hot_hot 时间: 2012-5-7 16:01

hcworld.com里面有比较复杂的配方，我用过，效果很好。
Normal Goat Serum Blocking Solution:

2% goat serum (blocking)

1%BSA (stabilizer)

0.1% cold fish skin gelatin (blocking)

0.1% Triton X-100 (penetration enhancer)

0.05% Tween 20 (detergent and surface tension reducer)

0.05% sodium azide (preservative)

0.01M PBS, pH 7.2

Mix well and store at 4 ºC.
通常我配500ml的不含血清的封闭液，高温灭菌之后4度保存。用的时候，临时加入相应浓度的血清。我的原则是如果你的二抗是羊抗兔，封闭液里就要加羊血清，如果是驴抗兔，封闭液里就要加驴血清。
封闭时间30min, 室温。一抗，二抗都用封闭液来稀释。你可以试着换换。洗的时候，我用的是PBST( 0.02% Tween 20).

关于对照的问题，我认为你应该用isotype control 而不是用省略一抗来做对照。

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 16:03

谢谢楼上。我换了山羊血清做封闭液，用4%多聚甲醛固定。一抗用封闭液稀释。二抗用pbs。做出来比之前的好多了。但对照组还是有一些非特异结合，是不是二抗也要封闭液稀释啊？下一步我准备把二抗稀释一下。
1%BSA (stabilizer)什么作用？

作者: kswl870 时间: 2012-5-7 16:04

1%BSA 是为了减少非特异性着色

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 16:05

"1%BSA 是为了减少非特异性着色 "

那山羊血清不就是封闭用吗，是不是加上BSA更好？

作者: redbutterfly 时间: 2012-5-7 16:06

这个问题仍然没有解决，请高手解答。封闭液类型，封闭时间都试过了

作者: october7 时间: 2012-5-7 16:06

我的封闭液10%的羊血清

你的抗体是不是单克隆抗体？

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