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标题: [求助]关于细胞计数法绘制生长曲线的困惑 [打印本页]

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-5-7 17:28 标题: [求助]关于细胞计数法绘制生长曲线的困惑

最近开始养肿瘤细胞，想测一下细胞的生长曲线，在园子里搜了一下，好多人用MTT法，由于条件有限，我打算用细胞计数法来做。
看了以前一位师兄的论文，他使用6孔板做的，每组细胞做3个复孔，接种前胎盘蓝计数活细胞，初浓度5000个/孔，加2ml生长液，分别培养24、48、72、96小时消化细胞并计数。
现在我的困惑是我应该准备多少快板？我只养一种细胞，每个时间点一个板吗？会不会太浪费？一块板计2个时间点，操作的过程中会不会污染啊？师兄的那个初浓度合适吗？按照最初的接种浓度一直养下去，到了规定的时间收细胞来计数是吗？我在瓶中养的细胞长的很快，隔一天就要传一代，那么在板中培养的过程中要换液吗？计数后的细胞怎么处理啊？由于刚开始养细胞，有诸多问题要请教，希望各位师兄师姐多赐教！谢谢！

作者: summerxx 时间: 2012-5-7 17:28

先看看司徒镇强的《细胞培养》上关于细胞生长曲线的介绍吧。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11971

作者: summerxx 时间: 2012-5-7 17:29

结果分析：

图片附件: 70967727.jpg (2012-5-7 17:29, 67.96 KB) / 该附件被下载次数 33
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11972

作者: summerxx 时间: 2012-5-7 17:29

生长曲线图：

图片附件: 60729127.jpg (2012-5-7 17:29, 57.82 KB) / 该附件被下载次数 43
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=11973

作者: +小生怕怕+ 时间: 2012-5-7 17:29

书上讲的是理论，但没有说具体的做法，理论和实践是有一定差距的。况且每个人的做法不同，我们没有老师指点，也没看师兄师姐做过，全靠自己摸索，耗时耗力，还是请前辈们多告诉我们初学者一些实践经验，少走弯路，谢谢！不胜感激！

作者: dotaaa 时间: 2012-5-7 17:30

我也是新手，今天刚听了一个同学给讲了下细胞计数，把其中能对你有所帮助的说一下：
1.我们这里计数一般用24孔板，一个就够了，每个时间点测三个孔取平均值，一共8个时间点。
2.至于初始浓度我也不知道多大合适。
3.从接种开始，其他孔的细胞一直养，每次计数时，其他孔就换相同量的培养基，计数后的细胞就直接扔掉了，如果自己有保存的话，我感觉。
希望对你能有所帮助~

作者: yhz1973 时间: 2012-5-7 17:30

细胞计数法做生长曲线用六孔板是可以的，每组3个复孔，每24h消化一组做细胞计数。
将两个时间点做在一个板上也没问题，只要你的操作过关是不会污染的。你也可以使用直径3.5cm的培养皿，他们与六孔板的孔大小是相同的，这样你就可以每次消化3个培养皿，分开操作。
关于细胞接种的初浓度，这要根据你的细胞生长速度以及你做生长曲线的时长来决定。最理想的是像popestudy发的那张图一样，呈一个S型的曲线。细胞接种的过密会使细胞过早的进入生长抑制期，接种的过稀会使细胞生长过缓，潜伏期过长，不能达到对数生长期，所以你需要摸一下条件。
关于换液问题，正常情况下在第48h或72h换液一次就可以了，但要小心不要把细胞冲掉了。
另外，细胞在计数后直接扔掉就可以了。如果你的细胞很珍贵，也可以回收，只要保证在计数的时候细胞不被污染可以接种到培养瓶中继续培养。

作者: dragonkilly 时间: 2012-5-7 17:31

我也是新手，今天刚听了一个同学给讲了下细胞计数，把其中能对你有所帮助的说一下：
1.我们这里计数一般用24孔板，一个就够了，每个时间点测三个孔取平均值，一共8个时间点。
2.至于初始浓度我也不知道多大合适。
3.从接种开始，其他孔的细胞一直养，每次计数时，其他孔就换相同量的培养基，计数后的细胞就直接扔掉了，如果自己有保存的话，我感觉。
希望对你能有所帮助~

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我现在也在用这种方法做生长曲线，但是用0.25%的胰酶消化后，用血细胞计数板无法读出细胞数，九个大格里总共只有几个细胞，而且细胞的形态不规则，不是圆形。但是消化之前观察发现，24孔板中的细胞汇合度可达70%。
不知道这是什么问题，会不会是胰酶的问题？或者还有别的需要注意的地方？恳请高人指点。

作者: plaa 时间: 2012-5-7 17:31

我也是刚做，起初接种密度是10的4次方，然后姨酶消化的时候又用PBS稀释了一倍，所以头3天在血球计数板里只能看到一两个细胞或者根本看不到细胞。我当时以为是自己技术问题，后来才想明白是因为密度太低了，10的4次方以下根本就在计数板上只能观察到个位数的细胞，假如再有小小的误差的话，可能就看不到了。后来在第5天，我看孔里都铺满了的时候再计数，就很乐观了，4个方格里的细胞数目很均匀，都是12个左右，所以就证实我前边的猜测是对的。现在我打算用MTT来做曲线，但是听说MTT变异很大，且经常和细胞计数辅助来进行细胞曲线。所以我不知道群里有哪位大虾能够指点一下10的4次方及以下浓度的用什么方法计数比较好？

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