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标题: [求助]MTT上板的细胞生长不好，为什么呢？ [打印本页]

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:25 标题: [求助]MTT上板的细胞生长不好，为什么呢？

刚过去的周末在上板，做MTT，可是忙活了一个周末。今天镜下观察了一下，结果却不好，会不会是和观察的时候隔着96孔板的盖子，而且有水气的关系，有些加了细胞的孔却几乎看不到细胞，死的都看不到。（今天是上药物24小时了，）郁闷的很，消化的细胞在96孔板生长不好，但是那些上板剩下来的细胞在培养瓶里却长的还可以。

我上的是7901， 7404 ， SKOV3, MCF7 , A375 . 一共五块板，不知道为什么就连阴性对照的细胞长得都不好（没有加药物，只是加了培养液），有的反而是药物的低剂量组的长的还可以，郁闷的是最近上的细胞都很不均匀，之前做别的细胞的时候，也是一样操作的，为什么这次会是这样的结果呢？

观察的时候看到A375细胞都是成团的生长的，以前也做个这个细胞的MTT ，长得很均匀的，为什么这次的会是这样的啊？细胞计数的时候都是单个细胞的啊，应该能分开的啊？

上周做的时候，因为胰酶不一样了，掌握不好时间，所以细胞消化过头了，但是这次我没有使用PBS 来冲洗（消化的时候），感觉上细胞就没有那么容易笑话过头，而且那些但是那些上板剩下来的细胞在培养瓶里却长的还可以。

各位高手指点一下啊。谢谢

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:27

就连阴性对照组的细胞看起来都是半死不活的状态，急啊

作者: jujuba 时间: 2012-5-10 15:29

没有遇到过这种情况，但是遇到过阴性对照的OD值比药物组还低的情况。

不理解楼主消化的时候为什么没有用PBS洗，以前的培养基残液不影响消化吗？
不影响的话，还要PBS干嘛？

不知道你的96孔板是新的还是旧的，可能没洗干净。以前实验室换洗瓶子的阿姨，刚开始就出现过这种情况，泡酸没洗干净，虽然保证无菌，但是残留的酸还是能杀死细胞。

如果是新的板子的话，那就无语了……

作者: gemei0115 时间: 2012-5-10 15:30

直接加进去胰酶而没有用PBS清洗的话，结果会有很多中情况：
一、残留血清抑制胰酶的作用，使得消化效果很不好，有可能你根本就没有把细胞吹下来，那么你传代到培养板里面的细胞很可能是贴壁不牢而老化的细胞（老化的细胞状态会好吗？）
二、其实我个人认为细胞传代时PBS清洗的作用不仅仅在于消除血清的干扰，还有一部分在于清洗细胞的一些代谢产物（当然包括一些酸性物质），你没有清洗，有可能这些残渣还留在培养瓶内，使得你的细胞状况下滑。
三、不承接上面的话题，楼主还要考虑两个方面：注意季节交换而影响细胞的状态，现在正是转冬的季节，有很多战友实验室条件并不是很好（主要只可能连空调都没有），这个时候要尽量避免将细胞在培养箱以外的环境中放置的时间过长，还有就是这个时候要注意胰酶的消化时间与夏季不一样了，当然如果战友们的实验室空调常年25°，完全可以不要有这样的顾忌。
四、注意细胞培养瓶，细胞培养皿，细胞培养板之间角色的转化。一种细胞对于玻璃制品的细胞培养瓶与塑料制品的细胞瓶的黏附能力是不一样的（当然我原因也不知道），所以当你从一个玻璃制品的培养瓶中将细胞传于塑料制品的培养板中的时候，就需要考虑这个问题了！所以建议，细胞培养瓶和培养板（塑料制品）都用同种制品的。个人意见，仅供参考！
祝你成功！

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:30

QUOTE:

原帖由 jujuba 于 2012-5-10 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
没有遇到过这种情况，但是遇到过阴性对照的OD值比药物组还低的情况。

不理解楼主消化的时候为什么没有用PBS洗，以前的培养基残液不影响消化吗？
不影响的话，还要PBS干嘛？

不知道你的96孔板是新的还是旧的，可能没洗干净。以 ...

没有加PBS是因为胰酶是新配制的，(0.25%胰酶+0.02%EDTA),消化能力很强，之前一次上板因为使用了PBS，才一加入胰酶，细胞几乎都下来了，后来上板后，根本没有贴壁，所以为了减少一点胰酶的消化能力，所以这次没有使用PBS来冲洗，这样做这次至少有的板是由细胞贴壁的，但是生长不好，而且也不均匀，细胞一副半死不活的样子，甚至是阴性组看以来也像是给了药物一样，不会是凋亡了吧？回头我把照片传上来。

我使用的是新的96孔板，这里的板是不重复使用的。而且所有清洗瓶子，消毒的工作……每一项，都是我认真的完成的。所以应该不是这个问题。这五块板普遍不均匀，生长的就算是同一快板，也有差别，有的甚至看不到细胞。老板知道结果的话，后果严重啊……

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:31 标题: 回复 #4 gemei0115 的帖子

谢谢你的建议，我们实验室常年使用空调，温度在25--27度之间。
使用的培养瓶和96孔板都是新的，塑料的，一次性的，都是外文，应该是进口的。但是培养瓶一般会在消化之后还是用2-3次，同一种细胞。

消化之后，一般习惯在镜下观察细胞是否已经吹打下来，所以一般都是将几乎所有细胞打下来之后，混匀，才计数，稀释，所以应该不是只有老的细胞下来了。但是我在7月份开始学习上板的时候也是不使用PBS的，但是效果还可以，但是不知道为什么现在这样，不是道是不是整体的细胞都太老了？

怎样判断细胞是否已经太老了呢？

作者: greenbee 时间: 2012-5-10 15:31

看楼主是有心人，一直在关注，所以谈一下自己的观点：
1 我在细胞传代，种板前也不用PBS洗（开始的时候洗，后来发现效果不明显，有时会增加污染几率），消化（10min）之后，镜下观察，如有部分细胞漂浮，轻轻拍打瓶底（有细胞消化下来就好了），细胞一般尽量避免不要吹打，就是要吹打最好不要产生泡沫。
2 分析楼主出现现象的可能原因：
“有些加了细胞的孔却几乎看不到细胞，死的都看不到。” 96孔板内细胞的数量估计太少了，也可能是细胞都在孔的边缘，这可能由于你加进去培养液少或者种板的时候没有边种边混匀细胞悬液造成的。

“阴性对照的细胞长得都不好"长的不好指的是什么。是细胞不贴壁还是长得慢啊！如果是长的慢，可能是密度有点低。如果是漂浮，那可能是污染，也可能是细胞老化了。

3 在中96孔板的时候，计数有时候不很准确，容易造成实际细胞密度与理论上的差距；在种板的过程中，由于没有排枪，所以的用加液枪种，在这个过程中，每种一组或各组的一个孔，都要重新混匀细胞，尽量避免细胞下层到底部，造成不均匀。（我以前经常会碰见种最后一孔的时候细胞很多）

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:34

谢谢楼上的朋友，我说的细胞长得不好是：贴壁了，但是感觉细胞像是死亡了，或者说是凋亡了，细胞看起来像是裂解了，我说的是阴性组，所以才纳闷。我一般在看板的时候，会习惯先使用低倍镜来观察所有的孔的长势，所以中间的和孔边缘的我都能看到的。然后才使用电脑拍摄下来每一组的照片，上药前后的，各组的，这样才好了解细胞对药物的反应。

计数很头大，这次的细胞的数量几乎是2万/ml,每孔加入200微升，所以细胞应该是4000左右，（这个数字应该是比较适中的）但是怎么看，细胞都太少了，当然这是因为细胞状态不好，繁殖复制不起来。

请问楼上的朋友你一般怎样吹打细胞，我这次是请师妹帮忙的，一直是以一定的均匀的速度来吹，然后我在同一点去细胞液。

对于难以吹散的细胞只能多吹，但是有担心会影响细胞活力，怎么办？？？各位高手支支招啊

是不是我还遗漏了什么呢？

作者: lixi559 时间: 2012-5-10 15:35

其实对细胞的消化可以适当的延长时间，在吹打大时候尽量少产生气泡（如果吹打适当不会产生气泡的），按你所要的密度种板后，待细胞贴壁后观察细胞长势，看细胞长的不是你预期的话，可以适当推迟种板的，当然这个很难把握，要求是在你加药处理的时间后使细胞长到95%左右吧。具体事项可以下边消息聊。

作者: yes4 时间: 2012-5-10 15:36

1.还是觉得消化的问题,
"A375细胞都是成团的生长的",你的胰酶是新配的,这次又没用PBS洗,虽然你计数的时候看的是单个细胞,但不能保证都是这样的,建议消化吹打之后看一下整体的情况;得到均匀的单个细胞是关键,至于吹打影响活力那是一定的,但整体细胞都一样(活力好或差一点),也会看出药物的作用效果的,当然活力好最好
2,消化后可以用培养基洗一次,可能会减少胰酶的损害
2,重悬后一定要吹打均匀再种板,你的种板密度好低(个人觉得,OD值大约多少呢),没有做过这些细胞.仅供参考.
祝好运.

作者: abc816 时间: 2012-5-10 15:36

A375的阴性组的OD最后是0.192--0.521之间，那个细胞根本没有长，我只是看看到底能怎样，才测量的。

长的稍微好一点的别的细胞，比如7901的阴性组的OD是0.349--0.632，这次的细胞几乎都是长在孔的边缘，中间就寥寥无几。

请问各位高手，如果算出来的抑制率是负数，那么在计算IC50的时候就可以不算在内了吧？那天我输入负号的时候，提示说请输入正确的数值。

如果统计出来的P值都大于0.05，是不是就没有计算IC50的必要了呢？

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