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标题: [求助]用药组细胞变大该怎么选定对照细胞 [打印本页]

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:26 标题: [求助]用药组细胞变大该怎么选定对照细胞

最近在做凋亡实验，annexin V+PI双染、rhodamin123测膜电位改变，都用的流式细胞仪，但碰到一点问题，希望高手能帮忙解惑

前期结果证明药物有明显的G2期阻滞作用，显微镜下观察到用药后细胞体积变得非常大，是正常细胞的2、3倍，问题就在这形态改变上。流式检测时要圈定一定位置上的一团细胞，用药组细胞体积变大后就没有与对照相对应的细胞，即若按照阴性对照组圈定位置，用药组细胞变大后在对应位置的小细胞数目就非常少；若圈定用药组的大细胞，对照组在对应位置又没有大细胞来做比较。

帮我检测的老师按经验都是以阴性对照的小细胞为准圈定对照位置，这样的话用药组的结果也是将对应位置的小细胞与阴性对照比较后得出，我觉得不太妥，因为药效之一就是明显的引起细胞变大，用药组还没变大的小细胞可能是还没发挥药效的细胞，把它们跟正常组的细胞比肯定都是没多大改变的，这也许就是我一直得到阴性结果的原因？

请高手帮忙，这样的情况应该怎么选定对照细胞呢？

作者: dog002 时间: 2012-5-15 12:27 标题: 回复 #1 彼岸花opp 的帖子

你可不可以分别分析,不用勉强固定需要圈定细胞的位置,即分析时移动门的位置.

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:27

细胞是在进样时就要圈定的吧？
因为实验室没有流式，所以我都是处理好样品送到医院测的，没那么方便可以自由控制改变分析条件。
做膜电位时曾经要求老师把圈定的范围扩大，把大小细胞都圈进去，结果就出现了三峰或者双峰，不是单峰

作者: sunnyB 时间: 2012-5-15 12:28

应该分析大的细胞，也就是主细胞群，如果细胞大的看不到细胞群时，就把EO改成E-1

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:28

用药组分析的是大细胞的话，那对照组怎么办？对照组都是正常的小细胞啊，没有大细胞。如果没有正常组的细胞作对照的话，也无法说明用药组的药效啊

作者: Ao7 时间: 2012-5-15 12:29

应该分别分析,其实圈细胞只是把你所要的细胞给圈出来.没那么多讲究的

作者: dongdongqiang 时间: 2012-5-15 12:29

在用Annexin V和PI测药物处理后诱导的凋亡时，“阴性”对照其实保护了两个概念。

一个是流式技术本身要求的对照（非标记标本），是每一个标本都要做的，用于扣除细胞本身的本底荧光，界定每个标本的阴性染色范围。也就是说，当你用了一个药物的两种剂量处理了一个时间的情况下（3个标本），如果不考虑补偿，你应该有6管上机检测（很多人会共用一个对照，这个其实是不严格，只不过如果药物处理对细胞背景影响不大的话，对结果影响不大；但我个人认为，这个对照的成本很低，没必要省略）。

第二个是实验组要求的对造，就是没有处理的细胞染色分析，如前所述，这个对造本身包括两管，根据其产生的数据来扣除细胞本底凋亡的情况，一个实验组中只要共有同一对造就可以了

所以就你的而言，不同的处理后，分别根据本处理条件下细胞形态的情况圈定目标细胞分析就可以了，没有必要去强求小细胞。最简单的做法，在所有的样品分析时，设个大大的门，只要去除细胞碎片，就可以了

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:30

这是圈定所有分析细胞的结果图（用药组）

图2（用药组1）的3、4区内可看到分离的两群细胞，偏靠4区的就是用药后的大细胞；图2（用药组2）整个细胞群都向右上角移，可看到一部分细胞移到了4区。

但做流式的老师说这样即使分布在4区也不能说这些就是凋亡了的细胞，因为它整体趋势是向右上角移的。那这样的话，应该怎么分析这个结果呢？细胞不凋亡直接坏死了？

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作者: ritou1985 时间: 2012-5-15 12:30

个人的感觉，机器应该没有调的十分到位，图1早期凋亡的细胞不多，没有被调到第四象限正确的位置，而是处于十字交叉的位置；所以图2中当早期凋亡明显时，那群凋亡的细胞看来就偏高，但是我觉得还是很明显分群了，应该就是早期凋亡的群体；图3中凋亡主要是晚期凋亡，应该也没有什么太大问题，不过药物处理后对细胞的非特异性结合Annexin V有一定影响，因此我认为图3中进入4象限的大多都不是凋亡细胞。

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:30

我感觉图3中跨度三四象限的细胞群就是图2中在第四象限的那群，因为他们在原分析图（圈细胞时的那个图）上是相同的位置，都属于大细胞所在的方位。因为他们整个都向右上角移，所以做流式的老师改变了进样条件把电压调下来了，要不然估计他们全部都得移到二象限去了。所以图3的分析条件和图1、图2 是不一样的

作者: ritou1985 时间: 2012-5-15 12:31

那我的感觉是，图3中细胞应该是全都凋亡了，这样压回来是错误的。这一组的药物浓度过高，我曾经用IGF-IR的抑制剂处理过白血病细胞，在药物浓度达到5uM的时候，和你这个的效果相似，应该是有非特性抑制造成的凋亡。

作者: 彼岸花opp 时间: 2012-5-15 12:31

请问你所说的非特异性抑制是怎样一种情况呢，什么状况下会发生？按目前的结果来看，能否请您帮我建议下我该如何改善我的实验。谢谢～～

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