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标题: [求助]下周开始做小鼠的HSCs 原代培养 [打印本页]

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:56 标题: [求助]下周开始做小鼠的HSCs 原代培养

如题
想找人学习。

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:57

Livers of 1-year-old male Wistar rats (450-500 g body mass, Interfauna), fed ad libitum on a stock diet, were perfused first with a Ca2+/Mg2+-free solution (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.6 mM NaH2P04 . 2H20, 0.8 mM NaHPO4.12H20, 10 mM Hepes, 0.5 mM EGTA, 4.2 mM NaHCO3, and 5 mM glucose, pH 7.4) for 10 min at 37°C and next with 0.05% collagenase solution (137 mM NaC1, 5.4 mM KC1, 0.6mM NaH2PO4.2H20, 0.8mM Na2HPO4.12H20, 3.8mM CaCl2, 10mM Hepes, 4.2mM NaHCO3 and 500 mg/l collagenase, pH 7.4) for 30 min at 37°C. The flow rate was 10ml/min. The digested liver was excised, dispersed in Ca2+/Mg2+-free solution and filtered through gauzes. Residual hepatocytes were removed twice by a low-speed centrifugation (50 g, 4"C, 2 min). The non-parenchy-ma1 cells were pelleted by centrifugation (450 g, 4"C, 10 min). A stellate-cell-enriched fraction was obtained by the use of centrifugation with a triple-layered (9, 11, 17%) Nycodenz cushion (1400 g, 4"C, 20 min). The cells in the upper layer were washed by centrifugation (450g, 4"C, 10min) and suspended in DMEM (GIBCO) supplemented with 10% fetal-calf serum (Boehringer Mannheim) and antibiotics (105U/1 penicillin G, 100 mg/l streptomycin, and 2.5 mg/l amphotericin . After plating, the culture medium was changed every other day.

这个是别人论文中的方法。请问小鼠的操作哪些与大鼠不同？谢谢

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:57

我换个问题，

大鼠的HSC和小鼠的HSC大小差很多吗？我isolation的时候如何选择filter的pore大小？大鼠文献上用100微米的，小鼠谁知道用多少的？谢谢

作者: zzzz 时间: 2012-5-18 17:58

这个是我自己的protocol，有问题大家一起学习吧。因为我怕翻译不好，直接将我自己的protocol贡献出来吧。

2008-5-23 HSCs isolation

Mouse livers were perfused through

1.  The portal vein with solution I for 5 min at 37°C at a flow rate of 7 ml/min. (35ml)

2.  Each liver was then perfused solution II for 10 min at 37°C at flow rate of 7 ml/min.(70ml)

3.  The liver was excised and incubated in digest solution (30ml) at 37°C for 20 min with gentle stirring.

4.  Stop digestion with 10% FBS(+)EMEM 15ml

5.  The incubating mixture was filtered through a mesh (pore size: 70 mm).

6.  The filtrate was centrifuged at 450 g for 7 min.

7.  The cell pellet was then resuspended in 5 mL of 15% OptiPrep, and loaded carefully with 5 mL of 11.5% OptiPrep, and centrifuged at 1400g for 17 min at 4°C.

8.  The cell fraction in the upper layer of 11.5% OptiPrep was gently aspirated, mixed with GBSS (5ml), and centrifuged at 1400g for 10 min at 4°C.

9.  the cell pellet resuspend in GBSS and was centrifuged at 450 g for 7 min

10.  cell pellet was resuspended in DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics (105 U/l penicillin G, 100 mg/l streptomycin) 2ml

11.  cultured on 24 wells plastic plates at 37°C in an incubator (5% CO2/95% air).

The purity of the cultures was evaluated by examining the characteristic stellate shape of the cells with phase-contrast microscopy and by the presence of lipid droplets by autofluorescence using an excitation light of 320 nm

作者: zzzz 时间: 2012-5-18 17:58

Solution I　
137 mM NaCl  8 g
5.4 mM KCl 0.402 g
0.6 mM NaH2PO4.2H2O 0.0936 g
0.8 mM Na2HPO4.12H2O 0.2865 g
10 mM HEPES 2.383 g
0.5 mM EGTA 0.190 g
4.2 mM NaHCO3　  0.3528 g
5 mM glucose 0.901 g
pH 7.4
Total 1L

Solution II
137 mM NaCl  8 g
5.4 mM KCl 0.402 g
0.6 mM NaH2PO4.2H2O 0.0936 g
0.8 mM Na2HPO4.12H2O 0.2865 g
10 mM HEPES 2.383 g
3.8 mM CaCl2.2H2O 0.5586 g
4.2 mM NaHCO3　  0.3528 g
5 mM glucose 0.901 g
180 mg/l collagenase type I (使用前加,现配)
pH 7.4
Total 1L

Digest solution
solution II containing 400 mg/l pronase and 20 mg/l DNase (使用前加,现配)

GBSS
NaCl, 7 g
KCl 370 mg
Na2HPO4 .2H2O 150 mg
KH2PO4  30 mg
MgCl2.6H20 376.8 mg
CaCl2.2H2O 225 mg
glucose  1 g
NaHCO3  2.27 g
Total 1 L

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:59

贴一张HSCs的图，显微镜100倍下照的。图中左下和右下形状不规则的为HSC，上边的条状细胞形态上看像kupper。周末用alpha-SMA 免疫染色，确认HSCs。

图片附件: 98794684.snap.jpg (2012-5-18 17:59, 16.62 KB) / 该附件被下载次数 126
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12119

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:59

alpha SMA 免疫组化图
4倍

图片附件: 66992478.snap.jpg (2012-5-18 17:59, 18.2 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12120

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 17:59

20倍

图片附件: 90434137.snap.jpg (2012-5-18 17:59, 12.58 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12121

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 18:00

40倍

图片附件: 49758089.snap.jpg (2012-5-18 18:00, 20.28 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12122

作者: summerxx 时间: 2012-5-18 18:00

第几天的细胞？

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 18:01

第几天的细胞？

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14天，中间7天的时候，分了一次dish

作者: 2541 时间: 2012-5-18 18:01

楼主这个方法里有个错误。吸取细胞层以后不可能用1400g这么大的离心力去沉淀细胞。这个参考文献的作者我特地写信去问过了，他承认是他们发在增补刊上的分离方法中写错了（具体文献名我不记得了，只记得文献是先发的，方法是后来增补刊的，好像是HEPATOLOGY）。应该是400g沉淀细胞，1400g梯度离心。至于其中的灌注时间，我记得酶液好像是各4分钟，文献里有讲到。我也做这个，希望和大家多讨论

作者: DDD 时间: 2012-5-18 18:02

楼上的你确定是密度梯度刚结束之后的离心是用400g吗？起初我也感觉用1400g对细胞活力是不是有影响？但是我看到该文通讯作者的2个文献一个是AJP的附件，一个是Hepatology的正文里都是写1400g。liangyuejin战友能把他们的回信发来看看吗？谢谢！：）

作者: DDD 时间: 2012-5-18 18:02

另外纠正下tk兄的图：放大倍数分别是40X、100X和400X,一般目镜是10X的。

作者: zhenxin 时间: 2012-5-18 18:03

相差的那张也是第14天的? 应该还没passage吧。

作者: zhenxin 时间: 2012-5-18 18:03

1400g没问题。

作者: kulee 时间: 2012-5-18 18:04

楼上的你确定是密度梯度刚结束之后的离心是用400g吗？起初我也感觉用1400g对细胞活力是不是有影响？但是我看到该文通讯作者的2个文献一个是AJP的附件，一个是Hepatology的正文里都是写1400g。liangyuejin战友能把他们的回信发来看看吗？谢谢！：）

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邮件被删掉了，你可以写邮件给那两个通讯作者，他们回复很快的。

作者: kulee 时间: 2012-5-18 18:04

1400g没问题。

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要这么大的离心力吗？我们一般离心细胞就300-500g，还请版主赐教。以前就经常向版主请教，在此先谢过了：）

作者: any333 时间: 2012-5-18 18:04

不是１４５０g吗？我分过大鼠的，小鼠的不好分，楼主很强！你们用的梯度介质是什么呀？怎么铺梯度呀？谢谢！

作者: pencil菲 时间: 2012-5-18 18:05

这个方法里有个错误。吸取细胞层以后不可能用1400g这么大的离心力去沉淀细胞。这个参考文献的作者我特地写信去问过了，他承认是他们发在增补刊上的分离方法中写错了（具体文献名我不记得了，只记得文献是先发的，方法是后来增补刊的，好像是HEPATOLOGY）。应该是400g沉淀细胞，1400g梯度离心。至于其中的灌注时间，我记得酶液好像是各4分钟，文献里有讲到。我也做这个，希望和大家多讨论

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请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

作者: duoduo 时间: 2012-5-18 18:08

终于找到有人提取小鼠HSC了，我们最近也在做，小鼠的不好做。tk57ml 能做出上面这么好的图片非常不错。向你学习。

作者: Ao7 时间: 2012-5-18 18:08

请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

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如果这样的话，为什么不用高速离心，比如15000g呢，那样不是可以离心时间更短，更快吗，可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g，太大离心力下细胞会死吧，至于多大算大，我没做过实验，没对比过，1400g是不是大？会死多少？我也不知道，我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以，这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的，有的只用300g，甚至250g离心沉淀细胞，时间稍微长点，应该也有他们一定的道理吧。个人观点。

作者: 49888 时间: 2012-5-18 18:09

要这么大的离心力吗？我们一般离心细胞就300-500g，还请版主赐教。以前就经常向版主请教，在此先谢过了：）

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我现在所在的实验室前面一个人用的差不多就是这个速度，不过，我最近改到做大鼠的450g了。

作者: glass 时间: 2012-5-18 18:09

关于灌注用的酶的浓度和量，有文章认为要根据不同的公司采用不同的浓度和量。而且很多参考文献中写的浓度和灌注量都有差别。
请教各位，灌注用的pronase，collagenase以及DNase大家用的是哪些公司的，用的浓度是多大，灌注Rat or mouse时灌注时间和速度分别是多少？？

作者: glass 时间: 2012-5-18 18:09

另外，这三个酶每次都要现配，而且用量都很少（几个mg），不知各位是怎么解决准确称量的问题。

作者: summerxx 时间: 2012-5-18 18:10

酶的用量，很多文献的说法都不同，pronase的说法是有毒性，collagenase也有文献报道会对某些细胞表面标志有影响，看你需要根据自己的实验决定浓度了。对于小鼠，灌注的速度应该要慢一点，否则，门静脉容易破。总之目的就是把肝脏灌注的烂掉，同时不能压力太大。还要，气泡不能进去，否则灌注效果很差。mg可以用精密天平称取，没有问题。

作者: pengke1983 时间: 2012-5-18 18:10

如果这样的话，为什么不用高速离心，比如15000g呢，那样不是可以离心时间更短，更快吗，可是好像一般做细胞的文献上沉淀细胞都是300-600g，太大离心力下细胞会死吧，至于多大算大，我没做过实验，没对比过，1400g是不是大？会死多少？我也不知道，我只是按照一般做法来做的。至于说400g以上都可以，这个说法好像不太准确吧。我们这里其他人做细胞的，有的只用300g，甚至250g离心沉淀细胞，时间稍微长点，应该也有他们一定的道理吧。个人观点。

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是的，离心力大确实会机械损伤细胞。我上面的提问重点只是想说，在合理范围之内，400g离心和1400g离心，结果似乎没有太多的区别（别的细胞不知道是什么情况，最起码小鼠的HSCs上是差不多的，因为2个我都试过了），这个问题类似于到底是400g离心沉淀好，还是500g离心好。个人观点。

作者: summerxx 时间: 2012-5-18 18:11

我孤陋寡闻，没看过用1400g沉淀细胞的。不过本文献作者告知，he made a mistake.

作者: ending 时间: 2012-5-18 18:11

请教各位高手，提取小鼠原代HSC时，我怎么做才能减少细胞污染？

作者: fei1226com 时间: 2012-5-18 18:12

谁做过提小鼠的原代HSCs的，可不可以把protocol发过来共享？

作者: october7 时间: 2012-5-18 18:12

不好意思，我可能没表达清楚，你的提HSC的PROTOCOL对我确实很有用，但我的细胞一提出来养了一天就有污染，我想问你是在什么环境中做的（超净台？），培养基用的是什么抗生素？浓度是多少？谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2012-5-18 18:12

请问，为什么不能用1400g的离心去沉淀细胞？本质上，这个操作只不过是为了让所有的细胞都沉淀下来，那么这个离心力只要能够达到沉淀的目的就可以的。400g以上都可以，没有硬性规定，我认为。

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我是顺藤摸瓜从实验动物技术版摸来的。看到这么热烈的讨论，也发表一下自己的看法。
支持tk57ml,离心速度没有硬性规定。自己实践一下，比读10篇文献强得多。tk57ml 自己已经试过了，在他的实验中没有问题。如果有人只信文献，还不停地讨论文献上是如何说的，就未免太...... 即使是文献上如何说的，也需要自己实践证实一下在自己的实验条件下是否可行。

作者: summerxx 时间: 2012-5-18 18:13

我是顺藤摸瓜从实验动物技术版摸来的。看到这么热烈的讨论，也发表一下自己的看法。
支持tk57ml,离心速度没有硬性规定。自己实践一下，比读10篇文献强得多。tk57ml 自己已经试过了，在他的实验中没有问题。如果有人只信文献，还不停地讨论文献上是如何说的，就未免太...... 即使是文献上如何说的，也需要自己实践证实一下在自己的实验条件下是否可行。

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离心细胞通常用的离心力是300-500g，这个离心力已经可以将细胞离心沉淀下来了。过大或者过长时间的离心，会导致细胞的死亡。正是由于我不信文献，才发现英文作者的笔误。完全照搬文献，是不可取的。

作者: cj_mondy 时间: 2012-5-18 18:13

贴一张HSCs的图，显微镜100倍下照的。图中左下和右下形状不规则的为HSC，上边的条状细胞形态上看像kupper。周末用alpha-SMA 免疫染色，确认HSCs。

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从楼主的这张图上可以看出里面混杂了不少的kupffer细胞。
我个人的体会发现11.5%的optiprep获得的细胞里含有不少kupffer细胞。
不知道楼主的纯度如何？

作者: cj_mondy 时间: 2012-5-18 18:14

从楼主的这张图上可以看出里面混杂了不少的kupffer细胞。
我个人的体会发现11.5%的optiprep获得的细胞里含有不少kupffer细胞。不知道楼主的纯度如何？

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这是第三天的图片。（X20）其中发亮的（脂滴）为星状细胞。黑色为吞噬了碳沫的kuppfer cell。而且里面还有不少成纤维细胞？（呈长梭形，不含脂滴）
具体见下图：可见11.5%optiprep获得细胞内含有不少kupffer细胞，不知楼主是否发生类似现象。

图片附件: 27514721.snap.jpg (2012-5-18 18:14, 37.12 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12123

作者: cj_mondy 时间: 2012-5-18 18:15

再贴一张，第7天的（X20)，也可以见到吞噬碳沫的kupffer cell 大多呈圆形或椭圆形。大部分我已用红色标出。希望能得到您的回复。

图片附件: 45272689.snap.jpg (2012-5-18 18:15, 70.27 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12124

作者: summerxx 时间: 2012-5-18 18:15

降低optiprep的密度

作者: vera+ 时间: 2012-5-18 18:16

我分别尝试了，10.5%（1.061）；10%（1.059）；9%（1.053）三个密度，随着密度降低HSC得率下降很快，纯度并不理想。觉得降低密度并不是好的纯化方法。

作者: shenkunjie 时间: 2012-5-18 18:16

I will isolute HSCs.In the literatruesolation and Culture of Hepatic Stellate Cells(Ralf Weiskirchen and Axel M. Gressner),Collagenase H (0.23 U/mg) means 0.23u collagenase I to 1mg liver tissue.
thanks

作者: shenkunjie 时间: 2012-5-18 18:17

for isolution of HSCs,Do you had centrifugated total liver cell suspension with percoll gradient?

作者: shenkunjie 时间: 2012-5-18 18:17

solution I Is D-hanks?Solution II is Hanks?

作者: lagua123 时间: 2012-5-18 18:18

我下个月就会开始做了，并且到时有一位好心的老师会亲自演示给我看。

作者: chuntian1983 时间: 2012-5-18 18:18

很无语，看了帖子，从头到尾就是纠结于400g和1400g，实践是检验真理的唯一标准

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