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标题: [分享帖]肝星状细胞实验步骤 [打印本页]

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 08:52 标题: [分享帖]肝星状细胞实验步骤

详细的protocol请参考
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/12033417')

实验步骤如下
小鼠3%戊巴比妥钠腹腔麻醉。
以“U”型切口打开腹腔。将肠管推向腹腔左侧，暴露门静脉及下腔静脉

[ 本帖最后由 fsdd817 于 2012-5-19 12:21 编辑 ]

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:10

剪一小口，将充满灌流液的针头经小口插入门静脉，止血夹夹住

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12129

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:21

打开恒流泵的开关开始灌流，并迅速剪断下腔静脉。肝脏在灌注开始几秒内变成黄白色（灌注结束的时候，肝脏上可见白色纹理）。

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:21

灌流结束，将肝脏移至培养皿中，加入少量（5ml左右）solutionII，显微镜下尽量去除胆管和血管，剪碎肝组织

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:22

将搅碎的肝组织倒入50 ml的离心管，加入solutionII至30ml，加入胶原酶，pronase和DNase，37度水浴消化12 min。（如果前面的灌注不好的话，可以适当延长消化时间）

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:23

消化结束的时候能够看到部分未消化完的肝组织。（不知道其他战友们消化的时候是否也是如此）

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:24

加入15ml血清终止反应。70μm过滤网过滤。
20G，4min离心，去除肝细胞（因为肝细胞重，所以会低速离心也能够沉下去）
收集悬浮液，450G，7min使悬浮液中的细胞都沉下去。吸掉悬浮液，加入15%optiprep，充分吹打，在其上轻轻加入5ml11.5%optiprep和5mlGBSS

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:25

1400G，17min 离心。
GBSS和11.5%optiprep间能够看到浅白色的条带

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:26

轻轻收集中间GBSS和11.5%optiprep间层5ml，加入5mlGBSS 450G，8min离心。吸掉悬浮液，加入适当的DMEM培养液，计数，培养

由于是拿手机拍得照片，可能不够清晰，请谅解。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:27

高手，小鼠也能插管，我的大鼠每次插管都容易脱管，惨啊，谢谢你的图片，很有参考价值

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:27

这个不难，多练习几次就好了。
插管可以用线绑住固定，或者用止血夹夹住。

作者: 小螺号 时间: 2012-5-19 12:28

你在动物房做不怕被污染的吗？

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:28

1。相对来说，我们动物房的中央空调很好的运转，通风比较好，没有那么脏。
2。我是灌流结束后的水浴锅开始是在另一个实验室。
3。我个人觉得，污染发生在开始培养后的操作不当，或者比如恒温箱等原因。因为第一步在体灌流不可能做到无菌，肯定会暴露到空气中。所以这一步会有一定的空气中的细菌进入你的系统当中。但是从灌流结束开始，进行了严格的无菌操作，所以一开始的那部分细菌会在各个操作过程中，越来越稀释。比如，一开始你在体灌流的时候有10个细菌贴附到你的肝脏，那么经过中间很多步操作，到最后你把细胞加入到培养基的时候，可能就只剩下1个或2个。然后还得看这个细菌是否适合在你的培养基条件下生存，能否抵抗你的培养基中的双抗的攻击，等等。所以，一开始所进入的污染相对来说影响没有那么大。

个人体会，请指教，谢谢。

作者: kswl870 时间: 2012-5-19 12:28

好贴！强烈同意TK兄的说法，开始无菌确实很难，不过也无妨。
也贴一张图，支持一下做HSC的同胞

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作者: duoduo 时间: 2012-5-19 12:29

谢谢两位分享经验。楼上，黑色的小鼠是C57吧？

版主，是否可以贴一张刚刚接种下去的细胞的图片呢？

作者: duoduo 时间: 2012-5-19 12:30

在细胞得率上，我有一点体会：就是在密度梯度离心之前，尽可能的得到单细胞悬液.
DnaseI的作用很关键，可以将细胞团块分散。

我的经验是，有一次取分层细胞的时候，不小心将枪头调入离心管中。分层被底部沉淀打乱，取出枪头后重新梯度离心，分层消失。

作者: tianmei001 时间: 2012-5-19 12:30

楼上说的很对，单细胞悬液很重要的，我也有同感
黑的小鼠是C57 的，以前拿来做门静脉穿刺练习的，刚开始操作失败很多次哦

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:30

现在tk57ml的SOP成了大家的主要参考，但是我有两个疑问：
1）消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶？如果加的话，浓度多少合适？

2）在消化后，有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗？

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:31

现在tk57ml的SOP成了大家的主要参考，但是我有两个疑问：
1）消化液是链霉蛋白酶E加DNaseI。为什么不加一点胶原酶？如果加的话，浓度多少合适？

2）在消化后，有加入含血清的培养基终止。胶原酶的消化真是可以被终止吗？

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1. 我的方法上，消化液从来都是有胶原酶的阿。呵呵，兄弟再看看我的protocl吧。
2. 血清本身不是抑制胶原酶的活性，而是通过降温和稀释来中止消化。所以我平时终止消化的是放在4度的含有血清的DMEM。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:31

果然如此，消化液是用solutionII配制的。

请问选择I型有其他的文献支持吗？因为我看在大鼠用的几乎都是IV型。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:32

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2012-5-19 12:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

果然如此，消化液是用solutionII配制的。

请问选择I型有其他的文献支持吗？因为我看在大鼠用的几乎都是IV型。

我是自己用collagenaseI和IV 做了平行比较后选择了I的。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:33

版主，我建议你在终止的时候用冷的DMEM就够了。因为血清是有粘度的，会让细胞聚成一团。这样可以得到更多的单细胞悬液。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:33

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2012-5-19 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
版主，我建议你在终止的时候用冷的DMEM就够了。因为血清是有粘度的，会让细胞聚成一团。这样可以得到更多的单细胞悬液。

请问普通DMEM和加了血清的DMEM 细胞得率有差异吗？我是说能够提高得率吗？因为我自己还没有比较过，不清楚。谢谢

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:35

有文献支持，说在梯度离心之前用含有DNaseI的DMEM洗涤一下沉淀。
这样可以使单个细胞游离出来。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:35

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2012-5-19 12:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有文献支持，说在梯度离心之前用含有DNaseI的DMEM洗涤一下沉淀。
这样可以使单个细胞游离出来。

但是含有DNase的DMEM洗的意义在于用DNase洗掉让细胞们凝聚的genome吧？

作者: qhyu 时间: 2012-5-19 12:36

是的，DNaseI 选择性作用于DNA

作者: cj_mondy 时间: 2012-5-19 12:36

肝灌流图片非常好,干净,但小塑瓶是做什么的?我们也在做HSC实验,用Percoll分离但效果不好, ficoll也做过分离HSC不好.

作者: DDD 时间: 2012-5-19 12:36

建议用optiprep，至少界面看的会清晰些。

终于看到师兄的实验室啦，哈哈！
分散细胞建议用含EDTA的溶液，一方面是螯合Ca2+，减少细胞间的黏附作用，二是Dnase发挥作用需要无钙的环境。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 12:36

浓度呢？以1mM 为宜还是2mM ？

我的细胞变成星形状态太快了。24h后就是星形的，而且细胞在培养的时候没有出现细胞成簇的现象。

不知道大家都用怎样的密度接种？

作者: DDD 时间: 2012-5-19 12:37

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2012-5-19 12:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

浓度呢？以1mM 为宜还是2mM ？

我的细胞变成星形状态太快了。24h后就是星形的，而且细胞在培养的时候没有出现细胞成簇的现象。

不知道大家都用怎样的密度接种？ ...

具体浓度我不记得了，跟PBSE中的一样，最好可以加入5%左右的BSA，对细胞形成保护作用，另外，BSA溶液可以在细胞膜外形成一层蛋白膜，阻止细胞间黏附的形成，减少细胞团块形成。

作者: yychen 时间: 2012-5-19 12:37

请教各位做HSC离心时用哪种低速离心机?普通和低温离心机没有这么低转速呀?20g \400g,?一般最低转速100r/min,也有750g呀??谢谢!!!

作者: yychen 时间: 2012-5-19 12:38

RFC按公式算与离心机本身显示不符,可能我弄错了.tk57ml能与我联系吗?我想请教一些问题.

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:39

补发２张照片
１. 20G　离心５min　后，肝细胞沉到下面

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作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 12:39

２. 取２完上面液体后剩下的肝细胞

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12138

作者: duoduo 时间: 2012-5-19 12:40

我们这里的离心机是500转=33g，1500转=450g

作者: cj_mondy 时间: 2012-5-19 12:41

现有人用Percoll分离肝星状细胞吗?

我在版上找过,按照贴子方法做,但不好,请求帮助.

作者: summerxx 时间: 2012-5-19 12:42

我个人认为你把链酶蛋白酶和DNA酶和在一起是不合适的，它两个的适合条件是不一样的，前者不要钙镁离子的参与，后者要，所以你可以考虑考虑把他两分开，试试

作者: is2011 时间: 2012-5-19 12:42

急！！有人用杰美基因的盒子分离过肝星状细胞吗！灌注泵可以用别的东西取取代吗，有没有卖的啊！我们找几个血管都好费事的，而且灌注还不怎么有效果，大鼠可以用吗？

作者: dragonkilly 时间: 2012-5-19 12:43

有没有人分离过肝脏库否细胞啊？听说不好分离！

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