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标题: [分享帖]小鼠肝星形细胞原代制备专帖 [打印本页]

作者: gmjghh 时间: 2012-5-19 15:01 标题: [分享帖]小鼠肝星形细胞原代制备专帖

分离小鼠HSC的主要技术难度是：星形细胞在肝脏细胞中的比例很小，所以1只小鼠得到的HSC细胞数目也非常少。

主要步骤是两步法:
1. 胶原酶消化，得到细胞悬液。
2. 密度梯度离心，利用HSC细胞脂肪含量高的特点，与其他肝脏细胞分离开来。

问题：
1. 如何避免污染
2. 如何保证完全消化
3. 如何进行密度梯度离心

作者: gmjghh 时间: 2012-5-19 15:02

1. Re:常用原代动物细胞培养(征稿，报名从速) [精华] （RAT）
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1943108&sty=3&keywords=%B8%CE%D0%C7%D7%B4%CF%B8%B0%FB+DMEM')

这个是详细的大鼠方法，供参考

2. 【求助】肝星状细胞（RAT）
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3310647_2.html?tpg=1')
好帖，单独列出来 juncaous为主要贡献者

3. 【原创】rHSCs isolation （RAT）
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=10438122&sty=1')
好帖，保护起来

作者: gmjghh 时间: 2012-5-19 15:03

不同的是密度梯度离心的介质选择是需要溶解的Nycodenz。而tk57ml选择是容易一些的optiprep。

我认为nycodenz也很好，关键是怎么去用。

楼上的知道nycodenz浓度和相应的buffer和密度之间的关系吗？

作者: gmjghh 时间: 2012-5-19 15:07

我查到的文献是8.2%Nycodenz可以分离小鼠HSC，请问可行吗？

Beneficial effect of glatiramer acetate (Copaxone) on immune modulation of
experimental hepatic fibrosis
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292: G628–G638, 2007.

作者: DDD 时间: 2012-5-19 15:08

最近没有实验，呵呵，用GBSS配8.2%的Nycodenz就行了。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 15:09

可以提供你的详细PROTOCOL吗？

特别是密度梯度离心操作这一步。我还没有考虑好怎么做。

配好的Nycodenz可以与细胞悬液混匀吗？还是不能混匀？怎样的体积比呢？

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 15:09

我这周有小鼠可以做一次。另外我optiprep也定出去了。是否等它到货之后再做呢？还在犹豫中呢。

作者: DDD 时间: 2012-5-19 15:10

个人感觉Nycodenz不如opti，所以建议你等到货再实验。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 15:11

我有一个问题请教：

你的Solution I 有考虑过渗透压吗？
按照我查到的资料，凡是加入HEPES的buffer 其中的NaCl需要减量，以维持等渗状态。

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 15:14

我用的也是C57小鼠，请多多交流。

作者: 园丁## 时间: 2012-5-19 15:14

我有一个问题请教：

你的Solution I 有考虑过渗透压吗？
按照我查到的资料，凡是加入HEPES的buffer 其中的NaCl需要减量，以维持等渗状态。

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是的，正常的生理盐水0.9%的渗透压大概在 300 mOsm/L，也就是人体的渗透压，而我的solutionI中的nacl的浓度是0.8%，低于0.9%，加上10mM的 HEPES的升高，渗透压应该是没有问题的。没有具体测试过，所以没有准确的数据。但是，通过细胞的存活率，也可以看出这个配方是没有问题的。请指教。

作者: HP007 时间: 2012-5-19 15:15

小鼠的我没有做过, 我是用大鼠的, 买的NYCO粉末, 自己配的, 其他都没有什么啦, 消化不好, 也没什么, 肝直接撕碎, 仍在酶液里振荡振荡, 关键是铺梯度, 液体只要按着PROTOCOL配, 渗透压不是大问题, 我甚至糊涂的时候用了双蒸水配梯度液, 都没什么,
文献上的8.2%Nycodenz, 肯定是分不出细胞的,
这个细胞挺怪, 分出来大致能看出纯度, 因为他们喜欢拥簇着生长, 看上去一簇簇的, 换换液就好了,
因为实验接近尾声, 不常分了,

作者: fsdd817 时间: 2012-5-19 15:15

文献上的8.2%Nycodenz, 肯定是分不出细胞的,

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请问能否告知你的密度铺的是多少？我不是指百分比，而是密度数字，1.***?

作者: 园丁## 时间: 2012-5-19 15:18

请问能否告知你的密度铺的是多少？我不是指百分比，而是密度数字，1.***?

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他们文献上给的一般是1.047-1.062 g/ml,但是低了,
梯度之后, 如果是云雾状很松散的一层, 那么肯定得不到多少细胞的,
大多的是碎片, 分的好的话会得到白色的紧凑的一层东东, 你一倾电动枪, 它自己就会跑上来了,如果细胞层颜色比较深，非常致密，说明纯度不够满意的,
至于密度, 小鼠和大鼠不能一概而论, 就是大鼠也有个体差异, 摸摸条件, 大鼠我建议用大些的, 不是说肝大, 确实是脂滴较多,在相同的密度梯度条件下容易上来,
我用那种600G左右的大鼠, 甚至更大, 密度设在1.070-1.072之间, 在接种密度不密不稀合适的情况下能得到七个100mmdish的量.

作者: 园丁## 时间: 2012-5-19 15:18

如果要做原代的, 要求纯度非常高的, 你可以密度适当降一些,
做穿一两代的, 想要得率高的, 适当提一点点, 还不是随心所欲,由你控制, 呵呵

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:19

他们文献上给的一般是1.047-1.062 g/ml,但是低了,
密度设在1.070-1.072之间, 在接种密度不密不稀合适的情况下能得到七个100mmdish的量.

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是的，我铺了1.066，但是还有一些肝细胞和fibro飘上来，但是再低了就怕连星状也沉下去，可能老鼠还是有点年轻了，再养几天，试一试老一点的小鼠看看。

谢谢提供经验。

作者: 园丁## 时间: 2012-5-19 15:19

是的，我铺了1.066，但是还有一些肝细胞和fibro飘上来，

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这个是不可避免的，就像人群中你也能揪出特别瘦和特别胖的人，
再提高一些，等出来的星状细胞多了，那么几个杂细胞就无足重轻了，
星状细胞本来就少，再加几个杂细胞，看上去当然感觉不好了
你不可能做到一个杂细胞都没有，最简单的：
纯度=HSCs/ 总细胞数

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:22

这个是不可避免的，就像人群中你也能揪出特别瘦和特别胖的人，
再提高一些，等出来的星状细胞多了，那么几个杂细胞就无足重轻了，
星状细胞本来就少，再加几个杂细胞，看上去当然感觉不好了

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是的，有几个杂细胞无所谓，呵呵，但是这几个杂细胞变多了就不大好了

作者: DDD 时间: 2012-5-19 15:24

这个是不可避免的，就像人群中你也能揪出特别瘦和特别胖的人，
再提高一些，等出来的星状细胞多了，那么几个杂细胞就无足重轻了，
星状细胞本来就少，再加几个杂细胞，看上去当然感觉不好了
你不可能做到一个杂细胞都没有，最简单的：
纯度=HSCs/ 总细胞数

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:25

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2012-5-19 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个是不可避免的，就像人群中你也能揪出特别瘦和特别胖的人，
再提高一些，等出来的星状细胞多了，那么几个杂细胞就无足重轻了，
星状细胞本来就少，再加几个杂细胞，看上去当然感觉不好了
你不可能做到一个杂细胞都没有，最简单 ...

你的纯度是什么时候计算的？用什么方法？确实一开始提取后荧光看的话纯度很高，然后等细胞活化后alpha-SMA 免疫染色，但是到了7天的时候，杂细胞会一簇一簇的分裂很多，比如kupper，比如fibro，一开始很少但是到了7天这个很少也会变很多。显然到了7天纯度不再是90%以上那么高了。不知道你有没有这个经验。

作者: 园丁## 时间: 2012-5-19 15:25

你的纯度是什么时候计算的？用什么方法？确实一开始提取后荧光看的话纯度很高，然后等细胞活化后alpha-SMA 免疫染色，但是到了7天的时候，杂细胞会一簇一簇的分裂很多，比如kupper，比如fibro，一开始很少但是到了7天这个很少也会变很多。显然到了7天纯度不再是90%以上那么高了。不知道你有没有这个经验。

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这是常识，
我已经说过了，我只能让它尽可能的纯，我做不到一个杂细胞都没有，（谁能做到告诉我一声）
只要有它就会不停的分裂，到7天的时候自然会增多，
不过原代细胞对我没有用，我是做传1-3代的，纯度和数目对我来说都没有问题，
你既然要做原代的，你就面临着鱼与熊掌的问题，你想提高纯度，得率不高；想有满意的得率，纯度会降低，除非你一天可以分他个三五只，

可以试着用CL2MDP去除枯否细胞，只是做脂质体本身不是一件轻松的事，
你明白实验中对照的重要意义了吧？

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:26

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2012-5-19 15:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的纯度是什么时候计算的？用什么方法？确实一开始提取后荧光看的话纯度很高，然后等细胞活化后alpha-SMA 免疫染色，但是到了7天的时候，杂细胞会一簇一簇的分裂很多，比如kupper，比如fibro，一开始很少但是到了7天这个很少也会变 ...

不好意思，刚开始学习细胞，所以有些常识不是很明白。那么论文中所说的纯度大于90%，是指刚分离的时候的；而过了几天，纯度也许就达不到90%，是吗？

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:26

我是做传1-3代的，纯度和数目对我来说都没有问题，

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如果一开始纯度不够的话，传代后能够解决这个问题吗？谢谢，请指教。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 15:28

细胞分离出来的时候，个体最大的就是HSC吧？

分离出来的时候我看了一下荧光，感觉最大的细胞呈蓝色，有自发荧光现象。

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:29

细胞分离出来的时候，个体最大的就是HSC吧？

分离出来的时候我看了一下荧光，感觉最大的细胞呈蓝色，有自发荧光现象。

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个体最大的是肝细胞，然后细杆状是kufpper，剩下的稍微小的是hsc

作者: DDD 时间: 2012-5-19 15:30

培养活化之后就清楚怎么样啦，Kupffer细胞活化的比较早。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 15:30

我太难过了，细胞分离出来不贴壁，可能是污染了；或者是消化过度。

作者: DDD 时间: 2012-5-19 15:30

又被污染了，我的天！长满了6孔板，什么都有霉菌细菌， ft。。

作者: gogo 时间: 2012-5-19 15:31

我建议你检查一下自己的试剂，可能是漏了一个没有用细胞培养级别的。最基本的就是无菌。

包括任何用过的试剂，全部检查一遍。

作者: ALALA 时间: 2012-5-19 15:37

day4，HSCs X100

图片附件: 30846707.snap.jpg (2012-5-19 15:37, 19.95 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12144

作者: gogo 时间: 2012-5-19 15:40

看看我的图片是什么？是HSC 吗？
10倍 2天

图片附件: 87130638.snap.jpg (2012-5-19 15:40, 18.08 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=12145

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